miR-139-5p通过靶向NOTCH-1增加结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的化疗敏感性

发布时间：2017-08-23 23:06

  本文关键词：miR-139-5p通过靶向NOTCH-1增加结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的化疗敏感性

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【摘要】：肿瘤耐药是指肿瘤细胞对化疗药物具有耐受性的现象,它不仅使药物疗效减弱,而且常常导致肿瘤化疗失败,是影响肿瘤复发甚至转移的重要因素。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)是目前结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)治疗的一线药物,它通过干扰细胞内DNA和RNA的合成抑制肿瘤的生长。虽然在治疗初期,大部分CRC细胞对5-FU敏感,肿瘤体积出现减小,但是由于肿瘤耐药的产生,5-FU并不能清除所有肿瘤细胞,5-FU耐药已经严重影响CRC的治疗,因此,鉴定出与5-FU耐药相关的生物分子对提高CRC的化疗效果十分关键。微小RNA(micro RNA,miRNA)是一类长度为20-25个核苷酸的非编码RNA,它通过靶向基因的3’UTR在转录后水平抑制所调控基因的表达,miRNAs的异常表达几乎在所有肿瘤中被检测到,影响了肿瘤的增殖、凋亡、迁移与侵袭等过程。miR-139基因位于11q13.4,其转录产物经加工可产生miR-139-5p和miR-139-3p两个成熟miRNA分子。我们先前的研究表明miR-139-5p在CRC中发挥着潜在的“抑癌基因”功能,miR-139-5p的低表达促进CRC细胞的迁移和侵袭,并且导致CRC病人的不良预后,但是,miR-139-5p与CRC耐药之间的关联并没有被系统地阐明。本研究中我们收集了未接受放化疗的CRC组织20例和接受了以5-FU为基础的新辅助化疗的CRC组织10例,并建立了对5-FU耐药的CRC细胞株(HCT-8/5-FU、HCT-116/5-FU)和miR-139-5p稳定过表达的CRC细胞株(HCT-116-miR-139-5p、LoVo-miR-139-5p);利用qRT-PCR检测5-FU诱导后miR-139-5p的表达情况,并用CCK-8实验确认miR-139-5p过表达对CRC细胞耐受5-FU的影响;接着用荧光素酶报告基因实验、免疫印迹和功能回复实验分析miR-139-5p影响CRC耐药的分子机制。结果表明,miR-139-5p在接受了5-FU为基础的新辅助化疗CRC病人肿瘤组织中或5-FU耐药的CRC细胞中均显著低表达;过表达miR-139-5p通过促进细胞凋亡增加CRC细胞对5-FU的化疗敏感性;荧光素酶报告基因实验、功能回复实验和免疫印迹研究显示,miR-139-5p增加CRC细胞对5-FU敏感性的分子机制是:靶向NOTCH-1,抑制其下游耐药相关基因MRP-1和BCL-2的表达;此外,NOTCH-1在5-FU耐药的CRC细胞中高表达,过表达miR-139-5p通过下调NOTCH-1逆转CRC细胞对5-FU耐药。本研究揭示了miR-139-5p/NTOCH-1信号通路在调控CRC细胞对5-FU化疗敏感性中的重要作用,其有望成为克服CRC细胞对5-FU耐药的新靶点。
【关键词】：结直肠癌 miR-139-5p 化疗耐药 NOTCH-1 5-氟尿嘧啶
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.34
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 缩略词8-9
• 第一章 绪论9-16
• 1.1 结直肠癌概况9
• 1.2 肿瘤耐药9-10
• 1.3 Micro RNAs10-12
• 1.3.1 miRNA与肿瘤11
• 1.3.2 miRNA与肿瘤耐药11-12
• 1.3.3 miRNA在肿瘤诊疗中的应用12
• 1.4 miR1395p与肿瘤研究进展12-14
• 1.4.1 miR1395p与肿瘤增殖12-13
• 1.4.2 miR1395p与肿瘤细胞周期13
• 1.4.3 miR1395p与肿瘤细胞凋亡13
• 1.4.4 miR1395p与肿瘤迁移及侵袭13-14
• 1.4.5 miR1395p与肿瘤耐药14
• 1.5 本课题研究的意义14
• 1.6 本课题研究的内容14-16
• 第二章 miR1395p对结直肠癌细胞耐受 5-FU的影响16-28
• 2.1 引言16
• 2.2 实验材料16-18
• 2.2.1 结直肠癌组织16
• 2.2.2 实验细胞株16-17
• 2.2.3 主要实验材料17
• 2.2.4 主要实验仪器17-18
• 2.3 实验方法18-22
• 2.3.1 结直肠癌组织收集及病理信息处理18
• 2.3.2 细胞培养及传代18
• 2.3.3 细胞冻存及复苏18-19
• 2.3.4 耐药细胞的诱导19
• 2.3.5 TRIzol法提取组织或细胞中的RNA19
• 2.3.6 将RNA逆转录成cDNA19-20
• 2.3.7 探针法qPCR检测miR1395p的表达20
• 2.3.8 慢病毒载体包装20-21
• 2.3.9 慢病毒感染21
• 2.3.10 CCK-8 检测药敏21
• 2.3.11 流式细胞术检测细胞凋亡21-22
• 2.3.12 数据统计分析22
• 2.4 结果与讨论22-26
• 2.4.1 诱导 5-FU耐药结直肠癌细胞22-23
• 2.4.2 构建miR1395p过表达结直肠癌细胞株23
• 2.4.3 -FU化疗后的结直肠癌组织或细胞中miR1395p的表达23-24
• 2.4.4 miR1395p对结直肠癌细胞耐受 5-FU的影响24-26
• 2.4.5 miR1395p对 5-FU诱导的结直肠癌细胞凋亡的影响26
• 2.5 本章小结26-28
• 第三章 miR1395p影响结直肠癌细胞对 5-FU耐受性的机制研究28-41
• 3.1 引言28
• 3.2 实验材料28-30
• 3.2.1 实验细胞株28
• 3.2.2 主要实验试剂28-29
• 3.2.3 引物及si RN A序列29-30
• 3.2.4 主要实验仪器30
• 3.3 实验方法30-35
• 3.3.1 Western Blot相关试剂的配置30-31
• 3.3.2 质粒转化感受态大肠杆菌31
• 3.3.3 大肠杆菌挑克隆实验31
• 3.3.4 质粒抽提31-32
• 3.3.5 荧光素酶报告基因实验32
• 3.3.6 细胞转染实验32
• 3.3.7 实时荧光定量PCR32-33
• 3.3.8 CCK-8 实验33
• 3.3.9 蛋白提取与浓度测定33-34
• 3.3.10 免疫印迹34-35
• 3.3.11 数据统计分析35
• 3.4 结果与讨论35-40
• 3.4.1 miR1395p靶向NOTCH-1 的 3’UTR抑制其表达35-36
• 3.4.2 miR1395p通过NOTCH-1 影响结直肠癌细胞对 5-FU的耐受性36-37
• 3.4.3 miR1395p抑制NOTCH-1 下游分子MRP-1 和BCL-2 的表达37-39
• 3.4.4 miR1395p/NOTCH-1 通路逆转结直肠癌细胞对 5-FU的耐药39-40
• 3.5 本章小结40-41
• 主要结论与展望41-42
• 主要结论41
• 展望41-42
• 致谢42-43
• 参考文献43-47
• 附录: 作者在攻读硕士学位期间发表的论文47

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