人源甲状腺未分化癌噬菌体单链抗体库的构建与筛选

发布时间：2017-08-29 04:30

  本文关键词：人源甲状腺未分化癌噬菌体单链抗体库的构建与筛选

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【摘要】：目的：构建天然人源甲状腺未分化癌噬菌体单链抗体库,并初步筛选出抗甲状腺未分化癌抗体。方法：提取ATC病人癌周淋巴结总RNA,逆转录cDNA。以此cDNA为模板分别扩增VH、VL基因片断,并与相应Linker连接；再采取重叠延伸PCR技术拼接组装成scFv基因片段。随后引入酶切位点sfiⅠ和NotⅠ,连接经双酶切后的scFv重组基因片段与质粒pCANTAB-5E。产物经化学转化并转入大肠杆菌TG1,超感染噬菌体,构建噬菌体单链抗体库。最后采用甲状腺未分化癌细胞为抗原对建立的抗体库进行4轮“吸附、洗脱、扩增”的筛选,并应用ELSIA方法鉴定其特异性。结果：成功获得约为750 bp的scFv基因。用pUC19标准质粒测定转化效率达到108 cfu/μg,双酶切鉴定scFv基因的阳性插入率为86.4%(19/22)。经过四轮亲和筛选,针对甲状腺未分化癌细胞的单链抗体得到明显富集,第四轮收获率为第一轮的77倍。ELSIA结果显示筛选出的抗体与甲状腺未分化癌细胞有特异的结合能力。结论：成功构建了人源甲状腺未分化癌噬菌体单链抗体库,并从中筛选出具有甲状腺未分化癌细胞特异性的人源噬菌体单链抗体。为下一步放免研究打下基础。
【关键词】：噬菌体展示技术 噬菌体单链抗体 甲状腺未分化癌 构建 筛选
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R736.1
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照6-8
• 中文摘要8-9
• 英文摘要9-11
• 第一部分：人源甲状腺未分化癌单链抗体库的构建11-32
• 前言11-12
• 1 材料12-16
• 1.1 主要试剂12
• 1.2 主要仪器12-13
• 1.3 试剂制备13-15
• 1.4 PCR引物15-16
• 2 方法16-25
• 2.1 总RNA提取16-18
• 2.2 扩增VH、VL18-19
• 2.3 扩增scFv基因19-21
• 2.4 构建重组质粒21-22
• 2.5 噬菌体抗体文库的构建22-23
• 2.6 抽提质粒和初步鉴定23-25
• 2.7 噬菌体抗体文库表达25
• 2.8 噬菌体滴度测定25
• 3 结果25-29
• 3.1 淋巴结总RNA25-26
• 3.2 VH、VL基因鉴定26-27
• 3.3 scFv基因的组装27-28
• 3.4 连接产物转化效率28
• 3.5 重组质粒的鉴定28-29
• 4 讨论29-31
• 5 小结31-32
• 第二部分：人源甲状腺未分化癌单链抗体库的筛选32-43
• 前言32
• 1 材料32-34
• 1.1 实验材料32-33
• 1.2 实验试剂33-34
• 2 方法34-36
• 2.1 细胞培养34-35
• 2.2 人源甲状腺未分化癌噬菌体scFv的淘筛35-36
• 2.3 Phage ELisa鉴定scFv特异性36
• 3 结果36-39
• 3.1 抗体库的筛选36-37
• 3.2 ELSA鉴定37-39
• 4 讨论39-42
• 5 小结42-43
• 全文总结43-44
• 参考文献44-49
• 文献综述49-57
• 参考文献53-57
• 致谢57-58
• 攻读硕士学位期间发表的论文58

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本文编号：751329