RBM4α对雌激素受体α的调控机理

发布时间：2017-08-30 05:18

  本文关键词：RBM4α对雌激素受体α的调控机理

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【摘要】：乳腺癌是一种发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。近年来,乳腺癌已成为危害我们广大女性朋友的重大疾病之一,它给女性带来了极大的困扰和痛苦。一半以上的乳腺癌是雌激素受体(estrogen receptor, ER)阳性的。ERa是调控ER阳性的乳腺癌发生发展的关键性因子。ERa作为转录因子发挥作用,与其他相关的辅调节因子密不可分。这些辅调节因子一般可与ERa直接或间接的相互作用,调控ERa在细胞中的定位、ERa的表达等等。RNA结合蛋白4a (RNA binding motif protein 4a, RBM4a)是一种新近发现的抑癌蛋白,可以通过调节靶基因前体mRNA(pre-mRNA)的可变剪接发挥抑制作用。RBM4a是RBPs家族蛋白,其家族成员RBM39可以与ERa发生相互作用,调节ERa的转录活性。RBPs家族结构具有很高的保守性,所以我的研究着手于RBM4a与ERa相互作用的检测,探究其中的生物学意义。本论文的主要内容包括：(1)在HEK-293T细胞和MCF7细胞中,我们通过免疫荧光、哺乳动物细胞双杂交以及免疫共沉淀等实验,研究了RBM4a和ERa之间的相互作用。结果表明,在细胞核内RBM4a和ERa发生相互作用。(2)在Hela细胞和MCF-7细胞中,我们通过蛋白质印记实验检测了RBM4a;对ERa蛋白水平的影响,实验结果表明,RBM4a以剂量依赖的方式下调ERα的蛋白水平,还发现RBM4a能够缩短ERa的半衰期。最终我们检测到RBM4a是通过促进ERa的泛素化降解降低了其蛋白水平。(3)在Hela细胞和MCF-7细胞中,我们通过报告基因实验和RT-PCR实验,研究了RBM4α对ERα的转录活性及其靶基因mRNA水平的影响。实验结果表明,在雌激素(estrogens, E2)存在的情况下,RBM4a能够抑制ERa的转录活性,并下调ERa下游靶基因Cyclin D1和GREB1的mRNA水平。进一步通过平板克隆形成实验和MTT实验检测了RBM4a对乳腺癌细胞功能的影响。结果表明,RBM4能够抑制ERa依赖的细胞增殖的能力。本论文首次将RBM4a与ERa联系在一起,确定RBM4a是ERa的一个负调控因子,能够抑制ERa介导的乳腺癌细胞的增殖。这为进一步了解乳腺癌的发生发展提供理论依据,为治疗ERa介导的乳腺癌提供了新的思路。
【关键词】：乳腺癌 ERα RBM4α
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 引言9-10
• 1 文献综述10-20
• 1.1 RBM4α的概述10-14
• 1.1.1 RBM4α的发现10
• 1.1.2 RBM4α的基本结构10-11
• 1.1.3 RBM4α的研究进展11-14
• 1.2 雌激素受体α概述14-18
• 1.2.1 ERα简介14-15
• 1.2.2 雌激素受体信号通路15-17
• 1.2.3 ER与乳腺癌17-18
• 1.3 本论文的选题依据和研究内容18-20
• 1.3.1 选题依据18-19
• 1.3.2 研究内容19-20
• 2 RBM4α与ERα之间的相互作用20-36
• 2.1 引言20
• 2.2 仪器与试剂20-23
• 2.2.1 仪器20-21
• 2.2.2 试剂和耗材21-22
• 2.2.3 溶液的配制22-23
• 2.2.4 菌种、细胞及质粒23
• 2.3 实验方法23-31
• 2.3.1 大肠杆菌感受态细胞的制备23-24
• 2.3.2 质粒的构建24-25
• 2.3.3 质粒的转化与提取25-26
• 2.3.4 细胞培养26
• 2.3.5 质粒转染26-27
• 2.3.6 免疫荧光(IF)27
• 2.3.7 免疫共沉淀(Co-IP)27-28
• 2.3.8 蛋白质印迹(Western blotting,WB)28-30
• 2.3.9 考马斯亮蓝(Bradfold)法测蛋白浓度30
• 2.3.10 哺乳动物双杂交30-31
• 2.4 结果与讨论31-35
• 2.4.1 IF检测RBM4α与ERα的共定位31-32
• 2.4.2 哺乳动物双杂交检测RBM4α与ERα之间的相互作用32-34
• 2.4.3 Co-IP检测RBM4α与ERα之间的相互作用34-35
• 2.5 小结35-36
• 3 RBM4α对ERα蛋白水平的影响36-43
• 3.1 引言36
• 3.2 仪器与试剂36-37
• 3.2.1 仪器36
• 3.2.2 试剂和耗材36
• 3.2.3 溶液的配制36
• 3.2.4 菌种、细胞及质粒36-37
• 3.3 实验方法37
• 3.3.1 细胞培养37
• 3.3.2 质粒转染37
• 3.3.3 免疫共沉淀实验(Co-IP)37
• 3.3.4 蛋白质印迹(Western blotting,WB)37
• 3.3.5 考马斯亮蓝(Bradfold)法测蛋白浓度37
• 3.4 结果与讨论37-42
• 3.4.1 RBM4α对ERα表达的影响37-39
• 3.4.2 RBM4α对ERα稳定性的影响39-40
• 3.4.3 RBM4α对ERα蛋白降解的影响40-42
• 3.5 小结42-43
• 4 RBM4α对ERα功能的调控43-56
• 4.1 引言43
• 4.2 仪器与试剂43-44
• 4.2.1 仪器43
• 4.2.2 试剂和耗材43-44
• 4.2.3 溶液的配制44
• 4.2.4 菌种、细胞及质粒44
• 4.3 实验方法44-49
• 4.3.1 细胞培养44
• 4.3.2 质粒转染44
• 4.3.3 荧光素酶报告基因实验44-45
• 4.3.4 RNA提取及检测45-46
• 4.3.5 反转录PCR(Reverse Transcription,RT-PCR)46-48
• 4.3.6 琼脂糖凝胶电泳(Agarose gel electrophoresis)48
• 4.3.7 平板克隆形成48-49
• 4.3.8 MTT比色法49
• 4.4 结果与讨论49-55
• 4.4.1 RBM4α对ERα转录活性的影响49-51
• 4.4.2 RBM4α对ERα下游靶基因mRNA水平的影响51-53
• 4.4.3 RBM4α对ERα促乳腺癌细胞增殖能力的影响53-55
• 4.5 小结55-56
• 结论56-57
• 参考文献57-61
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况61-62
• 致谢62-63

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 许兆伟;赵锋;伍会健;;ERα辅调节因子在乳腺癌中的双重调控作用[J];中国细胞生物学学报;2014年10期

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本文编号：757458