PD-Ll分子在肿瘤相关巨噬细胞介导肺癌免疫逃逸中的作用

发布时间：2017-09-05 01:19

  本文关键词：PD-Ll分子在肿瘤相关巨噬细胞介导肺癌免疫逃逸中的作用

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【摘要】：近年来肿瘤免疫治疗研究突飞猛进:机体免疫系统具有免疫监视清除肿瘤细胞的作用,在肿瘤的发生、发展及转移过程中扮演极其重要的角色。而肿瘤的免疫治疗与肿瘤微环境密切相关,肿瘤微环境由肿瘤细胞本身、间质细胞、微血管以及肿瘤浸润细胞,如树突状细胞、巨噬细胞等共同构成。作为肿瘤免疫发生的场所,肿瘤微环境中存在众多与肿瘤免疫相关的因素,包括细胞因子的负性调节作用,抑制性免疫调节细胞Treg、抑制性配体受体反应以及肿瘤微环境T细胞代谢活性的负调节等。研究显示,负性协同刺激分子PD-L1是近年来备受关注的免疫分子,PD-1/PD-L1信号通路激活可抑制肿瘤局部微环境CD4+T、CD8+T细胞的增殖和活化,免疫效应降低,从而介导肿瘤免疫逃逸,促进肿瘤生长。本文着重分析了PD-L1分子在肿瘤微环境中相关免疫细胞、肿瘤细胞上的表达,探讨其调节机制和生物学意义,为研究其介导肺癌免疫逃逸的机制提供新的证据。一、PD-L1分子在肿瘤相关巨噬细胞上的表达【目的】探讨恶性胸水中肿瘤相关巨噬细胞上PD-L1的表达及其临床意义。【方法】收集苏州大学附属第一医院呼吸科2013年10月到2014年10月期间收治的76例胸水患者临床资料。肺癌组52例,其中腺癌32例,鳞癌20例,另取结核性胸膜炎组24例作为研究对照组。收集胸水,采用ficoll密度梯度离心法获取胸水单个核细胞(PEMC),流式细胞术检测PEMC细胞表面肿瘤相关巨噬细胞上PD-L1、B7-H4的表达。【结果】肺癌恶性胸水与结核性胸水相比,PEMC细胞表面CD68+PD-L1+(30.16±16.64%vs 14.09±11.89,P0.01)、CD68+B7-H4+(16.97±10.32%vs 7.17±5.52%,P0.01)细胞及CD68+B7-H4+PD-L1+比例较高(11.05±9.51%vs 3.99±5.03%,P0.01)。在肺鳞癌和腺癌中,PEMC细胞中上述三种细胞群体CD68+PD-L1+(28.73±15.03%vs 32.44±19.13,P=0.440)、CD68+B7-H4+(17.83±10.73%vs16.58±12.35%,P=0.701)及CD68+B7-H4+PD-L1+(10.06±7.43%vs12.63±12.17%,P=0.348)比例未见差异(P值均大于0.05)。【小结】肺癌恶性胸水PEMC细胞中CD68+PD-L1+、CD68+B7-H4+、CD68+B7-H4+PD-L1+细胞比例均明显高于结核性胸膜炎组,对鉴别肺癌恶性胸水及结核性胸水具有一定的应用价值。二、肿瘤相关巨噬细胞对肺癌细胞上PD-L1分子表达的调节及其生物学意义【目的】研究肿瘤相关巨噬细胞对肺癌细胞膜表面PD-L1分子表达的调节作用,并探讨其生物学意义。【方法】(1)采用恶性胸水及胸水中肿瘤相关巨噬细胞培养上清(TAMs上清)培养肺癌细胞(A549细胞),流式细胞术检测A549细胞膜表面PD-L1表达,Transwell小室检测A549细胞侵袭能力的改变。(2)收集恶性胸水,采用ficoll密度梯度离心法获取胸水PEMC,流式细胞术检测PEMC细胞群中TAMs细胞内IL-6、IL-10、TNF-α以及INF-γ的表达。(3)采用IL-6、IL-10、TNF-α、INF-γ刺激A549细胞后,流式细胞术检测A549细胞膜表面PD-L1表达。(4)应用Western blot法检测IFN-γ刺激A549细胞后p-ERK、p-AKT以及p-Stat3的表达变化。(5)抑制ERK、AKT、Stat3信号途径,予IFN-γ刺激72h,检测A549细胞膜表面PD-L1的表达水平变化。(6)加入PD-1融合蛋白与IFN-γ诱导的A549细胞膜膜表面PD-L1分子发生配基化,采用CCK-8法检测细胞的增殖、流式细胞术检测细胞凋亡的改变以及Transwell小室检测细胞侵袭能力的变化。(7)应用RNAi干扰技术,沉默A549细胞PD-L1分子表达后,采用CCK-8法检测A549细胞的增殖、流式细胞术检测细胞凋亡的改变以及Transwell小室检测细胞侵袭能力的变化。【结果】(1)恶性胸水及胸水中TAMs上清刺激A549细胞后,其表面PD-L1表达均有升高,细胞的侵袭能力明显增强。(2)恶性胸水PEMC中TAMs内IL-10低表达,为2.76%,而IL-6、TNF-α以及INF-γ的表达均有较高表达,分别为:30.1%、40.2%、12.5%。(3)加入INF-γ刺激A549细胞后,其细胞膜表面PD-L1明显上调,而加入IL-6、IL-10、TNF-α后细胞膜表面PD-L1没有明显改变。(4)IFN-γ刺激A549细胞后p-AKT以及p-Stat3的表达增加,而p-ERK的表达未有明显改变。(5)分别抑制ERK、AKT、Stat3信号途径后,再给予IFN-γ刺激,A549细胞上PD-L1的表达水平分别为93.6%、43.8%和25.9%,表明抑制AKT、Stat3信号途径可阻断IFN-γ诱导的肺癌细胞表面PD-L1表达。(6)PD-1融合蛋白与A549细胞膜上诱导表达的PD-L1分子发生配基化后,随着PD-1融合蛋白浓度升高,细胞的增殖逐渐增加,凋亡逐渐减少,侵袭能力增强。(7)应用RNAi干扰技术,干扰PD-L1分子表达后,细胞增殖减少,凋亡增加,侵袭能力减弱。【小结】胸水中肿瘤相关巨噬细胞通过分泌IFN-γ上调A549细胞膜上PD-L1的表达,该过程需要PI3K/AKT、JAK/Stat3信号通路的参与。肺癌细胞膜上PD-L1分子的诱导性高表达,具有抗凋亡、促增殖的作用,细胞浆PD-L1分子在维系肺癌细胞的侵袭特性方面具有重要作用。
【关键词】：肺癌 肿瘤微环境 肿瘤相关巨噬细胞 细胞因子 PD-L1 信号通路
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 前言11-17
• 参考文献14-17
• 第一部分：PD-L1 分子在肿瘤相关巨噬细胞上的表达17-26
• 一、材料和方法17-19
• 二、实验结果19-20
• 三、讨论20-22
• 参考文献22-26
• 第二部分：肿瘤相关巨噬细胞对肺癌细胞上PD-L1 分子表达的调节及其生物学意义26-57
• 一、材料和方法26-37
• 二、实验结果37-49
• 三、讨论49-53
• 参考文献53-57
• 本课题研究结论57-58
• 展望58-59
• 综述59-66
• 参考文献62-66
• 缩略词表及注释66-68
• 攻读学位期间公开发表论文68-69
• 本课题获得基金资助69-70
• 致谢70-71

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本文编号：794969