PLK1 shRNA干扰对鼻咽癌CNE2细胞生长和侵袭的影响

发布时间：2017-09-05 07:33

  本文关键词：PLK1 shRNA干扰对鼻咽癌CNE2细胞生长和侵袭的影响

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【摘要】：[目的]Polo样激酶1(polo-like kinase1,PLK1)是一种丝/苏氨酸蛋白激酶,因在细胞周期中起重要作用而受到广泛关注。我们前期实验发现EBV转化淋巴母细胞中PLK1表达上调。大量研究表明PLK1在人类多数肿瘤中高表达,下调PLK1的表达可显著抑制肿瘤细胞的生长。本实验通过体外细胞实验,研究PLK1表达下调后对鼻咽癌细胞生长及侵袭等生物学行为的影响,阐明PLK1在肿瘤发生中的作用,为鼻咽癌(NPC)的靶向治疗提供理论依据。[方法]构建针对PLK1基因的干扰质粒p GPU6/GFP/Neo-sh PLK1及空质粒p GPU6/GFP/Neo-sh NC,通过lipo fectamine TM 2000脂质体分别转染鼻咽癌细胞系(CNE2),G418筛选稳定转染细胞系,荧光显微镜观察细胞内绿色荧光表达情况,q RT-PCR、Western Blot分别检测转染前后PLK1基因的m RNA及蛋白在各组细胞中的表达情况。采用CCK-8、细胞划痕、流式细胞术分析、平板克隆形成及细胞迁移侵袭等实验,观察PLK1表达改变对CNE2细胞增殖和侵袭等生物学行为的影响。[结果]1.成功建立PLK1稳定低表达的CNE2细胞系。荧光显微镜观察显示转染组携带绿色荧光的细胞数达到90%;测序结果经Pub Med在线BLAST比对显示,目的基因的干扰质粒p GPU6/GFP/Neo-sh PLK1吻合率达100%,证明载体构建成功;q RT-PCR、Western Blot检测发现转染p GPU6/GFP/Neo-sh PLK1质粒的细胞(实验组)较转染p GPU6/GFP/Neo-sh NC(阴性对照组)和普通CNE2细胞(空白组)相比,PLK1基因的m RNA转录及蛋白表达水平均明显降低,表明成功建立PLK1稳定低表达的CNE2细胞系。2.沉默PLK1表达可抑制CNE2细胞的增殖及侵袭能力。CCK8及平板克隆实验结果显示:实验组CNE2/sh PLK1较阴性对照组CNE2/sh NC及空白组CNE2相比,生长速度及克隆形成率均降低,且差异具有统计学意义(P0.05),表明PLK1表达下调能抑制CNE2细胞的增殖。流式细胞仪检测显示:转染PLK1低表达质粒的细胞CNE2/sh PLK1较阴性对照组CNE2/sh NC及空白组CNE2相比,G2期细胞百分比明显升高,S期细胞百分比明显降低,且凋亡细胞百分比升高,表明PLK1表达下调能导致CNE2细胞发生G2期阻滞,诱导细胞凋亡。划痕实验、迁移及侵袭实验结果显示:转染PLK1低表达质粒的细胞CNE2/sh PLK1较阴性对照组CNE2/sh NC及空白组CNE2相比,迁移及侵袭能力均降低,且差异具有统计学意义(P0.05),表明PLK1表达下调能降低CNE2细胞的侵袭能力。[结论]PLK1表达下调可抑制CNE2细胞的生长、增殖及侵袭能力。
【关键词】：PLK1 鼻咽癌 CNE2 表达下调 靶向治疗
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.63
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 第1章 绪论12-16
• 第2章 材料与方法16-30
• 2.1 实验材料16-18
• 2.1.1 主要实验仪器16-17
• 2.1.2 主要实验试剂17-18
• 2.1.3 质粒和细胞株18
• 2.1.4 其他18
• 2.2 实验方法18-30
• 2.2.1 CNE2细胞培养18-19
• 2.2.2 载体构建19-21
• 2.2.3 CNE2稳定干扰细胞系的建立21
• 2.2.4 Western blot检测21-23
• 2.2.5 qRT-PCR检测23-26
• 2.2.6 CCK-8 实验(Cell Counting Kit-8)26
• 2.2.7 平板克隆实验26-27
• 2.2.8 迁移实验27
• 2.2.9 侵袭实验27
• 2.2.10 划痕实验27-28
• 2.2.11 流式细胞术检测28
• 2.2.12 统计学分析28-30
• 第3章 结果30-40
• 3.1 阳性克隆的测序鉴定30
• 3.2 成功构建PLK1稳定低表达的CNE2细胞系30-34
• 3.2.1 荧光显微镜观察结果30-31
• 3.2.2 Western Blot检测PLK1蛋白水平31-32
• 3.2.3 q RT-PCR检测PLK1 mRNA水平32-34
• 3.3 PLK1低表达对CNE2细胞生物学行为的影响34-40
• 3.3.1 绘制细胞生长曲线34-35
• 3.3.2 平板克隆实验35-36
• 3.3.3 流式细胞术检测36
• 3.3.4 迁移实验36-37
• 3.3.5 侵袭实验37-38
• 3.3.6 划痕实验38-40
• 第4章 讨论40-46
• 第5章 结论46-48
• 参考文献48-52
• 文献综述52-66
• 参考文献61-66
• 作者攻读学位期间的科研成果66-68
• 本研究课题资助项目68-70
• 致谢70-71

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1 周燕;PLK1 shRNA干扰对鼻咽癌CNE2细胞生长和侵袭的影响[D];南华大学;2015年

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本文编号：796665