沉默PKM2对体外培养肺腺癌A549细胞及移植瘤辐射效应影响的实验研究

发布时间：2017-09-07 01:16

  本文关键词：沉默PKM2对体外培养肺腺癌A549细胞及移植瘤辐射效应影响的实验研究

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【摘要】：目的:研究沉默丙酮酸激酶M2型(PKM2)对体外培养肺腺癌A549细胞的放射敏感性及移植瘤的放射协同作用,同时探索潜在的相关机制。方法:1.采用Western Blot法检测正常肺上皮BEAS-2B细胞及多种非小细胞肺癌细胞系中PKM2蛋白的表达水平。将干扰PKM2基因的质粒psh RNA-PKM2,转染至肺腺癌A549细胞建立稳定细胞系,同时设立psh RNA-Control空载质粒转染组和未转染Control组,采用Western Blot法检测psh RNA-PKM2的沉默效率。2.采用台盼蓝细胞活性测定法和克隆形成实验分别检测沉默PKM2及加入细胞自噬抑制剂3-MA和细胞凋亡抑制剂z-VAD-fmk后,放疗对A549细胞活性和克隆形成能力的影响。采用免疫荧光实验检测各组细胞经处理后细胞损伤蛋白γ-H2AX的表达水平。3.采用TUNEL法和流式细胞术分别检测沉默PKM2的及加入抑制剂不同组别A549细胞放疗后的凋亡水平。4.采用透射电镜和Western Blot法分别检测沉默PKM2及加入抑制剂经放疗后A549细胞的自噬体和自噬小泡形成情况及通路相关蛋白的表达水平变化。5.采用免疫组织化学法检测裸鼠移植瘤psh RNA-PKM2的干扰效率。干扰PKM2表达的荷瘤裸鼠移植瘤经放疗后,用游标卡尺监测裸鼠移植瘤体积的动态变化,TUNEL法检测各组裸鼠移植瘤细胞的凋亡率,并采用透射电镜观察裸鼠移植瘤细胞内自噬体和自噬小泡的形成情况。结果:1.与正常肺上皮细胞相比较,A549、H460、H1299、H292和H520五种非小细胞肺癌细胞中PKM2呈高表达;成功获得转染psh RNA-PKM2的A549稳定细胞株,体外实验psh RNA-PKM2组可显著降低细胞PKM2的蛋白表达水平(P0.05)。2.沉默PKM2表达可显著增加肺腺癌A549细胞的放疗敏感性。与对照组相比较,照射12h与24h后,psh RNA-PKM2组细胞存活率分别减少了(12.6±5.21)%与(20±4.57)%,照射组(IR组)分别减少了(17.1±5.14)%与(28.2±6.52)%,而IR+psh RNA-PKM2组分别减少了(27.7±5.14)%与(48.7±7.52)%;克隆形成实验显示:IR组与psh RNA-Control组的D0值和Dq值相类似,而psh RNA-PKM2组的D0值和Dq值比其余两组均降低(P0.05)。psh RNA-PKM2组与psh RNA-Control组的SERD0值分别为1.47与1.01,表明psh RNA-PKM2组细胞克隆形成能力显著下降。照射后12h与24h,A549细胞损伤蛋白γ-H2AX增多,而psh RNA-PKM2组细胞损伤蛋白γ-H2AX明显增多,提示:沉默PKM2后,照射显著增加DNA双链断裂(P0.05)。3.沉默PKM2显著增加A549细胞放疗所诱导的凋亡。相比Control组和psh RNA-Control组相比,psh RNA-PKM2组和IR组的细胞凋亡率增加,而IR+psh RNA-PKM2组的凋亡细胞率显著增加(P0.05)。加入凋亡抑制剂z-VAD-fmk后,细胞凋亡率显著降低(P0.05)。4.沉默PKM2可增加A549细胞放疗诱导的自噬。透射电镜观察显示:IR+psh RNA-PKM2组出现大量自噬小泡和自噬体,psh RNA-PKM2组、IR组和IR+psh RNA-Control组则少量形成,其余组无自噬小泡和自噬体。LC3-II/I比值表达水平显示:LC3-II/I比值在psh RNA-PKM2组增高(灰度值1.33),IR+psh RNA-PKM2组显著增加(灰度值1.59),但IR+psh RNA-PKM2组加入自噬抑制剂3-MA后则显著降低LC3-II/I比值(灰度值0.87)(P0.05)。检测通路相关蛋白的表达:与其他组相比较,IR+psh RNA-PKM2组显著降低AKT和PDK1的磷酸化水平,而增加ERK1/2和GSK3b的磷酸化水平表达。5.z-VAD-fmk和3-MA处理后,台盼蓝染色检测细胞存活能力显示:相比IR+psh RNA-PKM2组,照射后12h与24h,加入z-VAD-fmk和3-MA细胞组的细胞存活率显著增加(P0.05)。克隆形成实验显示,加入抑制剂组的克隆形成能力较IR+psh RNA-PKM2组显著增强(P0.05)。同时加入抑制剂后,对细胞死亡方式检测显示:与IR+psh RNA-PKM2组相比较,IR+pshRNA-PKM2+3-MA的细胞凋亡减少;采用Western Blot检测IR+psh RNA-PKM2+z-VAD-fmk组的LC3表达水平显示:LC3-II/I的比值显著降低(灰度值0.75,P0.05)。以上结果提示:沉默PKM2后经放疗诱导的A549细胞凋亡与自噬之间存在交互作用。6.干扰裸鼠移植瘤PKM2的表达水平,通过诱导自噬和凋亡增加放射协同作用。体内实验显示:psh RNA-PKM2可显著降低移植瘤的PKM2表达水平(P0.05)。与对照组比较,IR组与psh RNA-PKM2组可显著抑制移植瘤的生长(P=0.04),IR+psh RNA-PKM2组则显著抑制移植瘤的生长(P=0.001)。与IR组及psh RNA-PKM2组相比较,IR+psh RNA-PKM2组显著增加移植瘤的生长延迟时间(P=0.04、0.01)。以上结果表明:沉默PKM2对移植瘤可能具有放射协同作用。体内实验采用TUNEL法检测显示:IR+psh RNA-PKM2组凋亡细胞率较其他组别显著增加(P0.05)。且psh RNA-PKM2+IR组出现大量自噬小泡和自噬体形成,psh RNA-PKM2组及IR组则少量形成,其余组无自噬小泡和自噬体。结论:沉默PKM2调节自噬和凋亡可能提高人肺腺癌A549细胞的放射敏感性及移植瘤的放射协同作用,其有望成为放疗肺腺癌的有效增敏靶点,但有待进一步研究证实。
【关键词】：丙酮酸激酶M2型 放射治疗 自噬 凋亡 人肺腺癌
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-10
• 缩略语/符号说明10-11
• 前言11-13
• 研究现状、成果11-12
• 研究目的、方法12-13
• 1. 对象和方法13-33
• 1.1 实验材料13-14
• 1.2 实验所需主要试剂及溶液的配制14-17
• 1.3 主要仪器设备17
• 1.4 实验方法17-32
• 1.5 统计学分析32-33
• 2. 结果33-42
• 2.1 正常肺上皮和非小细胞肺癌细胞PKM2表达及稳定细胞株的建立33-34
• 2.2 沉默PKM2表达增加肺腺癌A549细胞的放疗敏感性34-35
• 2.3 沉默PKM2增加A549细胞放疗诱导的凋亡35-36
• 2.4 沉默PKM2增加A549细胞放疗诱导的自噬36-38
• 2.5 沉默PKM2后放疗诱导A549细胞的凋亡与自噬间的交互作用38-39
• 2.6 干扰小鼠移植瘤PKM2的表达，，通过诱导自噬和凋亡增加放射协同作用39-42
• 3. 讨论42-45
• 结论45-46
• 参考文献46-53
• 发表论文和参加科研情况说明53-55
• 综述 PKM2在肿瘤中的作用55-68
• 综述参考文献60-68
• 致谢68

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本文编号：806559