Wnt通路肿瘤抑制基因去甲基化在黑树莓多酚防治结直肠癌中的作用研究

发布时间：2017-09-07 22:10

  本文关键词：Wnt通路肿瘤抑制基因去甲基化在黑树莓多酚防治结直肠癌中的作用研究

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【摘要】：结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一,在所有癌症中结直肠癌的全球病发率位居第三。肿瘤的发生已被普遍认为是由于遗传学和表观遗传学层面上的改变而引起的。DNA甲基化是最普遍研究的表观修饰现象,并且通过修饰CpG二核苷酸阻止转录复合物结合到DNA上,进而沉默功能基因。并且DNA甲基化是可逆过程,可以通过作用于DNA甲基化的可逆过程逆转结直肠癌肿瘤抑制基因启动子高甲基化状态。目前认为靶向蛋白分子药物的开发是对结直肠癌治疗的新研究方向。黑树莓(BRB)是富含鞣花酸、花青素等酚酸类成分的天然水果。前期研究发现,BRB冻干粉对于结直肠肿瘤具有良好的预防作用。本研究主要应用现代分离方法制备纯化获得BRB多酚,将其分别处理AOM+DSS诱导的结直肠癌肿瘤小鼠动物模型及人类结直肠癌细胞,考察Wnt相关肿瘤抑制基因的表观遗传异常逆转在其肿瘤预防中的重要作用及对人类结直肠细胞增殖、凋亡和转移的信号通路调节作用。结果表明：(1)在体内实验中,黑树莓多酚逆转Wnt通路肿瘤抑制基因WIF1、SFRP2的高甲基化状态,并上调其蛋白水平进而下调Wnt通路关键因子β-catenin的蛋白水平。与此同时,黑树莓多酚下调调控甲基化的DNA甲基化转移酶DNMT1、 DNMT3A、 DNMT3B的表达。因此,结果显示黑树莓多酚防治结直肠癌的表观遗传机制是通过降低DNMTs的蛋白表达抑制肿瘤抑制基因DNA甲基化过程,阻止功能基因SFRP2、 WIF1沉默。通过其高表达抑制Wnt/β-catenin信号通路进而抑制细胞增殖达到结直肠癌防治作用。(2)在体外实验中,结果显示,黑树莓多酚抑制人类结直肠癌细胞LoVo、 HCT-116的增殖。逆转Wnt通路肿瘤抑制基因WIF1、SFRP2的高甲基化状态,并上调其蛋白水平进而下调Wnt通路关键因子β-catenin的蛋白水平进而抑制结直肠癌细胞的增殖。黑树莓多酚下调细胞周期蛋白、基质金属蛋白酶,上调抗凋亡蛋白、钙黏蛋白表达进而抑制结直肠癌细胞的增殖转移促进其凋亡。综上所述,黑树莓多酚抑制结肠癌作用机制之一是通过下调DNA甲基化转移酶的蛋白水平逆转肿瘤抑制基因SFRP2、WIF1启动子区域的高甲基化状态,使SFRP2、WIF1蛋白水平升高抑制降低β-catenin蛋白表达进而抑制Wnt/β-catenin信号通路最终达到降低结直肠癌细胞增殖的作用。此外,黑树莓多酚通过作用于凋亡、转移等其他信号通路关键蛋白发挥降低结肠癌的发生和转移的活性。基于上述的实验结果,黑树莓多酚的肿瘤预防作用及机制的研究具有重要的意义,黑树莓多酚作为一种新型制剂在防治结直肠癌的原发上具有很大的潜能,从长远来看,具有更好的临床应用前景。
【关键词】：结直肠癌 黑树莓多酚 甲基化 SFRP2 WIF1
【学位授予单位】：辽宁大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.34
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-13
• 引言13-22
• 0.1 结直肠癌13-14
• 0.2 黑树莓多酚14-15
• 0.3 表观遗传与肿瘤15-17
• 0.4 天然化合物与肿瘤表观遗传学17-20
• 0.5 研究目的及意义20-22
• 第1章 黑树莓多酚对结肠癌细胞存活和生长的影响22-27
• 1.1 引言22
• 1.2 实验材料22-23
• 1.2.1 细胞株、生化试剂和耗材22
• 1.2.2 主要仪器设备22-23
• 1.2.3 试剂的配制23
• 1.3 实验方法及步骤23-25
• 1.3.1 HCT-116和LoVo细胞的培养23-25
• 1.4 实验结果与讨论25-26
• 1.5 结论26-27
• 第2章 黑树莓多酚抑制结肠癌的表观机制研究27-44
• 2.1 引言27
• 2.2 实验材料27-31
• 2.2.1 细胞系、动物模型、生化试剂和耗材27-29
• 2.2.2 主要仪器设备29
• 2.2.3 试剂的配制29-31
• 2.3 实验方法及步骤31-38
• 2.3.1 溃疡性结肠炎癌变小鼠模型建立31-32
• 2.3.2 小鼠肠上皮细胞的获取32
• 2.3.3 HCT-116和LoVo细胞的处理和收集32
• 2.3.4 肠上皮细胞及体外培养细胞基因组DNA的提取32-33
• 2.3.5 甲基化特异性PCR(MSP)33-35
• 2.3.6 肠上皮细胞及体外培养细胞总蛋白质的提取35
• 2.3.7 细胞总蛋白质浓度的测定(BCA法)35-36
• 2.3.8 蛋白质免疫印迹(Western Blot)36-38
• 2.4 实验结果与讨论38-43
• 2.4.1 黑树莓多酚上调结肠癌肿瘤小鼠肠上皮细胞SFRP2表达38
• 2.4.2 黑树莓多酚上调HCT-116和LoVo结肠癌细胞SFRP2、WIF1表达38-39
• 2.4.3 黑树莓多酚下调结肠癌肿瘤小鼠肠上皮细胞Wnt/β-catenin信号通路关键因子39-40
• 2.4.4 黑树莓多酚下调LoVo和HCT-116结肠癌细胞Wnt/β-catenin信号通路关键因子40
• 2.4.5 黑树莓多酚下调结肠癌肿瘤小鼠肠上皮细胞SFRP2启动子甲基化水平40-41
• 2.4.6 黑树莓多酚下调HCT-116和LoVo细胞SFRP2、WIF1启动子甲基化水平41-42
• 2.4.7 黑树莓多酚下调结肠癌肿瘤小鼠肠上皮细胞DNA甲基转移酶表达42-43
• 2.5 结论43-44
• 第3章 黑树莓多酚抑制结肠癌生长、转移和凋亡作用的潜在机制研究44-49
• 3.1 引言44
• 3.2 实验材料44-45
• 3.3 实验方法45
• 3.3.1 HCT-116和LoVo细胞的处理和收集45
• 3.3.2 体外培养细胞总蛋白质的提取45
• 3.3.3 细胞总蛋白质浓度的测定(BCA法)45
• 3.3.4 蛋白质免疫印迹(Western Blot)45
• 3.4 实验结果与讨论45-48
• 3.4.1 黑树莓多酚对HCT-116和LoVo细胞周期蛋白表达的影响45-46
• 3.4.2 黑树莓多酚对HCT-116和LoVo细胞凋亡蛋白表达的影响46-47
• 3.4.3 黑树莓多酚对HCT-116和LoVo细胞转移相关蛋白表达的影响47-48
• 3.5 结论48-49
• 第4章 结论与展望49-51
• 致谢51-52
• 参考文献52-59
• 攻读学位期间发表学术论文及参加科研情况59

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

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本文编号：810173