缺氧诱导因子1α调控2型谷氨酰胺酶促进结肠癌耐药的机制及临床意义研究

发布时间：2017-09-08 08:33

  本文关键词：缺氧诱导因子1α调控2型谷氨酰胺酶促进结肠癌耐药的机制及临床意义研究

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【摘要】：结肠癌是人类最常见的消化道肿瘤之一,其发病率和死亡率多年来居高不下。近年来随着化疗方案的不断更新使得结肠癌的治疗效果有所提升,但患者对治疗反应不一,获益率差异较大,以及由耐药引起的复发和转移是进一步提高疗效的主要障碍。代谢模式的多样性是恶性肿瘤的重要特征,其不仅在肿瘤发生发展中发挥重要作用,同时也是恶性细胞在面对化疗压力时得以存活的根本保障。因此,深入研究结肠癌化疗耐受情况下肿瘤代谢改变及调控机制,不仅可以阐明结肠癌化疗耐受的分子机制,而且可以通过对特定细胞代谢途径或代谢产物的调控,为逆转耐药寻找新的靶点。缺氧是实体肿瘤的重要特征之一,而缺氧诱导因子1α(HIF-1α)作为其关键的中间分子,在对肿瘤代谢等方面起着主要的调控作用。同时缺氧条件下谷氨酰胺(Gln)的转运、合成与利用均增加,但是具体的分子机制目前尚不明确。Gln在其代谢关键酶2型谷氨酰胺酶(GLS2)的作用下脱氨基生成谷氨酸(Glu)。一方面,Glu可反应生成α-酮戊二酸进入三羧酸循环(TCA循环)起“回补作用”,从而为TCA循环提供因肿瘤细胞合成代谢增强而减少的中间代谢产物;另一方面,Glu可在谷胱甘肽合成酶系的催化下,生成谷胱甘肽(GSH)与多种化疗药物反应,增加药物的排出,降低药物在细胞内的浓度以及增强DNA损伤修复功能,最终引起肿瘤细胞的耐药。在本研究中,我们发现缺氧条件下结肠癌细胞株对化疗不敏感,同时耐药结肠癌细胞株中HIF-1α和GLS2的表达均升高,在此基础上,初步探讨了HIF-1α通过对GLS2进行调控影响了谷氨酰胺的代谢,最终引起结肠癌化疗耐受,为逆转耐药提供新的策略。同时,采用免疫组化法检测了HIF-1α和GLS2在结直肠癌组织标本中的表达,并且探讨其临床意义,进而为临床诊治提供新的线索。实验方法:第一部分(1)分别在常氧(20%O_2)和缺氧(1%O_2)不同时间点(12h、24h、36h、48h、72h)的条件下处理结肠癌细胞株Lovo后,Western Blot检测HIF-1α的表达;(2)分别在20%O_2和1%O_2条件下用结肠癌化疗药物奥沙利铂(OXA)和5-氟尿嘧啶(5-Fu)处理Lovo细胞48h后,CCK8检测细胞增殖活性;(3)Western Blot检测HCT-116、HCT-116/OXA、HCT-8和HCT-8/5-Fu中HIF-1α、缺氧诱导因子2α(HIF-2α)、1型谷氨酰胺酶(GLS1)和GLS2的表达。第二部分(1)通过慢病毒敲低HIF-1α,构建HIF-1α~(KD)的Lovo细胞株,在20%O_2和1%O_2处理12h后,Western Blot检测HIF-1α和GLS2的表达;(2)通过慢病毒过表达HIF-1α,构建HIF-1α~(OE)的Lovo细胞株,Western Blot检测HIF-1α和GLS2的表达;(3)通过临床数据库ICGC对GLS2和不同HIF-1α靶基因之间的表达相关性进行分析;(4)通过基因数据库分析GLS2启动子序列与HIF-1α靶基因序列的相似程度;(5)荧光素酶报告基因检测HIF-1α对GLS2转录的启动活性。第三部分(1)通过慢病毒敲低HIF-1α~(OE)组Lovo细胞中的GLS2,构建HIF-1α~(OE)+GLS2~(KD) Lovo细胞株;(2)GSH检测试剂盒分别检测WT、Ctr、HIF-1α~(OE)、HIF-1α~(OE)+GLS2~(KD)四组Lovo细胞中GSH水平;(3)分别用OXA和5-Fu处理WT、Ctr、HIF-1α~(OE)、HIF-1α~(OE)+GLS2~(KD)、HIF-1α~(OE)+H2O_2五组Lovo细胞48h后,CCK8检测细胞增殖活性。第四部分(1)免疫组化法检测结直肠癌术后108例组织标本(其中23例含癌旁黏膜组织)中HIF-1α和GLS2的表达,并分析二者的表达与临床病理参数的相关性;(2)采用Spearman等级相关分析HIF-1α和GLS2的表达之间的相关性,Kaplan-Meier法分析结直肠癌中HIF-1α和GLS2的表达与患者预后的关系,Cox回归模型分析结直肠癌患者预后的影响因素。结果:1、缺氧通过促进HIF-1α的表达参与结肠癌细胞耐药1%O_2处理Lovo细胞12h时HIF-1α表达水平最高;OXA或5-Fu处理细胞后,1%O_2组的Lovo细胞增殖活性均较20%O_2组强;相较于野生型结肠癌细胞株HCT-116和HCT-8,耐药细胞株HCT-116/OXA和HCT-8/5-Fu中HIF-1α和GLS2的表达均增高,而HIF-2α和GLS1无明显变化。2、HIF-1α通过转录调控促进GLS2的表达缺氧时敲低HIF-1α,GLS2的表达随之降低;常氧时过表达HIF-1α,GLS2的表达随之升高;临床数据库ICGC分析发现GLS2和不同HIF-1α靶基因之间的表达存在明显正相关;基因数据库TRANSFAC MATRIX TABLE分析GLS2启动子序列与HIF-1α靶基因序列的相似度为99.8%;荧光素酶报告基因发现HIF-1α能够启动GLS2的转录,同时将GLS2的启动子序列突变以后HIF-1α对其的启动活性随之下降。3、HIF-1α通过提高GSH水平促进结肠癌细胞耐药过表达HIF-1α时GSH水平升高,敲低GLS2后GSH水平随之下降;OXA或5-Fu处理细胞后,过表达HIF-1α时细胞增殖活性增强,但在加入H2O_2或敲低GLS2后,细胞的增殖活性随之下降。4、HIF-1α和GLS2在结直肠癌中的表达及临床意义结直肠癌组织中HIF-1α和GLS2的表达均明显高于癌旁黏膜组织,且差异具有统计学意义(P0.01)。其中,HIF-1α的表达与年龄、TNM分期、淋巴结转移、术后远处转移有关(P0.05),而GLS2的表达则与年龄、浸润深度、术后远处转移有关(P0.05)。同时,HIF-1α和GLS2的表达呈显著正相关(r=0.464,P0.01),且二者均与结直肠癌患者的预后有关;Cox回归分析也显示TNM分期、术后远处转移、HIF-1α、GLS2均是结直肠癌预后的独立影响因素(P0.05)。结论:HIF-1α作为重要的转录因子,缺氧时其表达明显增高,且与结肠癌耐药密切相关,它通过转录调控GLS2的表达,促进GSH的合成进而引起结肠癌细胞的化疗耐药;同时结直肠癌患者中HIF-1α、GLS2高表达组的预后均比低表达组的差,提示二者可能在结直肠癌的发生、发展中起着重要的作用。
【关键词】：结肠癌 缺氧诱导因子1α 2型谷氨酰胺酶 化疗耐药 奥沙利铂 5-氟尿嘧啶
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.35
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 英文摘要7-11
• 中文摘要11-14
• 第一章 前言14-16
• 第二章 缺氧通过促进HIF-1α 的表达参与结肠癌细胞耐药16-26
• 2.1 材料与方法16-23
• 2.2 结果23-24
• 2.3 讨论24-25
• 2.4 小结25-26
• 第三章 HIF-1α 通过转录调控促进GLS2的表达26-36
• 3.1 材料与方法26-31
• 3.2 结果31-34
• 3.3 讨论34-35
• 3.4 小结35-36
• 第四章 HIF-1α 通过提高GSH水平促进结肠癌细胞耐药36-43
• 4.1 材料与方法36-39
• 4.2 结果39-41
• 4.3 讨论41-42
• 4.4 小结42-43
• 第五章 HIF-1α 和GLS2在结直肠癌中的表达及临床意义43-49
• 5.1 材料与方法43-45
• 5.2 结果45-48
• 5.3 讨论48
• 5.4 小结48-49
• 全文总结49-50
• 参考文献50-54
• 文献综述 缺氧和缺氧诱导因子与肿瘤代谢54-64
• 参考文献60-64
• 研究生期间主要发表的论文64-65
• 致谢65

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本文编号：812988