FoxP3对甲状腺乳头状癌中NIS表达的影响及机制研究

发布时间：2017-09-08 11:43

  本文关键词：FoxP3对甲状腺乳头状癌中NIS表达的影响及机制研究

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【摘要】：背景甲状腺乳头状癌(Papillary thyroid carcinoma,PTC)是最常见的内分泌系统恶性肿瘤,其预后通常较好,十年生存率约达90%。甲状腺癌术后,放射性碘治疗是其常规后续治疗手段,但一些病人表现出对放射性碘治疗耐受。目前有大量文献指出病人这种对放射性碘治疗的耐受与位于甲状腺细胞膜的钠碘转运体(sodium iodine symporter,NIS)表达下调有关。NIS介导了碘由细胞外向细胞内的转运,为甲状腺激素的合成提供了原料,其表达主要受TSH的调控,TSH不仅能促进NIS的表达水平,而且能使其正确定位于细胞膜上。除TSH外,转化生长因子β1(Transforming growth factor,TGF-β1),雌激素和碘在NIS的调节上也起着重要作用;其中,TGF-β1主要通过拮抗TSH的生物学效应来发挥其抑制甲状腺功能及NIS表达的作用。Smads家族是一类细胞内信号转导因子,主要位于TGF-β信号通路的下游发挥作用。TGF-β1首先结合到细胞表面一种特异性激酶(TGF-βtype II receptor,TβR-II)上,从而导致了TβR-I的激活,后者又使R-Smad2和R-Smad3磷酸化,磷酸化的R-Smad2和R-Smad3继而与Smad4共同转移到细胞核中调节相应基因的表达。叉头状转录因子P3(Forkhead box P3,Fox P3)是CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs)生长和分化的重要调节因子。一直以来都认为Fox P3仅限定于Treg细胞中特异性表达,直到Hanz在胰腺癌细胞中亦发现了它的表达,接下来在多种癌细胞株中都发现其有不同程度的表达。Fox P3在肿瘤细胞中能够模仿其在Treg细胞中的功能,它通过促进免疫抑制性细胞因子如TGF-β1分泌来抑制肿瘤特异性T细胞,从而使肿瘤逃离机体的免疫监视。此外,有研究显示Fox P3高表达和病人对放射性碘治疗抵抗有关。由于病人对放射性碘治疗的耐受与NIS表达下调有关,且Fox P3在多种肿瘤中都能促进TGF-β1分泌,而TGF-β1又是NIS表达强有力的抑制因子,因此推测Fox P3可能通过诱导TGF-β1信号通路的激活来下调NIS的表达。在本研究中,采用免疫组织化学和荧光定量PCR检测90例甲状腺乳头状癌标本和40例正常甲状腺组织中Fox P3和NIS的表达。此外,本研究组成性激活型(Constitutively active,CA)Fox P3过表达慢病毒载体来上调Fox P3的表达及活性,观察在甲状腺乳头状癌细胞中Fox P3对NIS表达水平的影响。目的1.探讨Fox P3与甲状腺乳头状癌临床病理特征及NIS表达的关系;2.观察Fox P3对人甲状腺乳头状癌细胞中NIS表达的影响,并对其机制进行初步探讨。方法1.采用免疫组织化学和荧光定量PCR检测90例甲状腺乳头状癌标本和40例取自癌对侧叶的正常甲状腺组织中Fox P3和NIS的表达。2.人甲状腺乳头癌细胞株TPC-1于含10%胎牛血清的1640培养基中培养。用不同浓度的人重组TGF-β1(1,5,10 ng/m L)处理后,Real-time PCR检测NIS m RNA的表达,Western blot检测其蛋白水平的表达。3.构建含组成性激活型(Constitutively active,CA)Fox P3编码序列的慢病毒载体(LV-CA-Fox P3)及空慢病毒载体(LV-NC-GFP),并转染于TPC-1,倒置荧光显微镜观察GFP的表达,流式细胞仪检测转染效率。4.将细胞分为对照(NC)组,过表达Fox P3(LV-CA)组及空病毒载体(LV-NC)组,Real-time PCR检测Fox P3和TGF-β1的m RNA表达;Western blot检测Fox P3,TGF-β1及TGF-β1通路下游重要成员TβR-I,Smad3和p Smad3的蛋白表达;免疫荧光检测Fox P3,TβR-I和Psmad3的表达;ELISA检测细胞培养上清液的TGF-β1水平。5.将细胞分为对照组,LV-CA组,LV-CA加不同浓度的TGF-β1单克隆抗体组(1μmol/L,5μmol/L,10μmol/L)以及LV-NC组,Real-time PCR检测六组细胞NIS m RNA的表达,Western blot检测其蛋白的表达。结果1.免疫组化结果显示Fox P3在甲状腺乳头状癌中的阳性率为74%,而在正常组织中均为阴性表达,且Fox P3与甲状腺外侵犯及淋巴结转移(P0.05)有关。2.在正常甲状腺组织中NIS主要定位于细胞膜,在肿瘤组织中其表达显著减少,尤其在Fox P3阳性的样本中,并且这些低表达的NIS主要定位于胞浆中。3.免疫组化结果显示甲状腺乳头癌中Fox P3阳性患者的NIS表达阳性率显著低于Fox P3阴性患者(P0.05)。Real-time PCR结果显示甲状腺乳头癌中Fox P3阳性患者NIS的m RNA水平显著低于Fox P3阴性患者(P0.05)。4.与对照组相比,随着培养基中TGF-β1浓度的增加,NIS的m RNA和蛋白表达均逐渐减少;当TGF-β1的浓度达到最大(10 ng/m L)时,NIS的m RNA和蛋白含量分别下降至对照组的6倍和2倍。5.倒置荧光显微镜观察结果显示LV-CA和LV-NC组细胞中表达大量的GFP,而未转染组细胞不表达。流式细胞仪显示对照组,LV-CA-Fox P3组和LV-NC组的GFP阳性率即转染效率分别为0.2%,99.3%和99.3%。6.与对照组相比,LV-CA组Fox P3和TGF-β1的m RNA和蛋白表达显著增加(P0.05);ELISA结果显示与对照组相比,LV-CA组细胞上清液中TGF-β1的分泌显著增加(P0.05);Western blot结果显示LV-CA组TβR-I和p Smad3的蛋白表达较对照组显著增加(P0.05),而Smad3无明显变化。7.免疫荧光结果显示,Fox P3在LV-CA组细胞中大量表达,且主要位于细胞核中,而在正常组和LV-NC组细胞中Fox P3的表达量则很低。与正常组和LV-NC组细胞相比,LV-CA组细胞的TβR-I和p Smad3表达水平显著增强,而Smad3的表达在三组细胞间无统计学差异。8.与NC组相比,LV-CA-Fox P3组NIS的m RNA和蛋白表达水平均显著降低(P0.05),但随着TGF-β1单克隆抗体浓度的不断增加,NIS的m RNA及膜蛋白表达均逐渐恢复至接近正常。结论1.Fox P3在甲状腺乳头状癌中的高表达与甲状腺腺外侵犯及淋巴结转移有关,且其高表达可能下调NIS的水平;2.甲状腺乳头状癌中Fox P3对NIS的下调通过TGF-β1/Smad信号通路介导。
【关键词】：甲状腺乳头癌 叉头状转录因子P3 钠碘转运体 TPC-1细胞 转化生长因子β1 Smad蛋白家族
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R736.1
【目录】：

• 摘要4-8
• Abstract8-14
• 中英文缩略词14-16
• 前言16-19
• 1 材料与方法19-33
• 2 结果33-35
• 3 讨论35-38
• 4 结论38-39
• 附图39-47
• 参考文献47-50
• 综述 叉头状转录因子P3和甲状腺乳头状癌的关系50-71
• 参考文献62-71
• 个人简历71
• 在学期间发表的学术论文与研究成果71-72
• 致谢72

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本文编号：813842