端粒酶抑制剂MST-312对人肝癌HepG2细胞辐射敏感性的影响及机制探讨

发布时间：2017-09-08 23:50

  本文关键词：端粒酶抑制剂MST-312对人肝癌HepG2细胞辐射敏感性的影响及机制探讨

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【摘要】：目的：研究端粒酶抑制剂MST-312对人肝癌HepG2细胞辐射敏感性的影响并探讨其作用机制。材料和方法：应用MTT法对MST-312的细胞毒性进行检测,筛选合适的药物浓度；选取X射线2 Gy对MST-312预处理的细胞进行辐照后,采用克隆形成实验检测细胞存活率,观察MST-312对细胞的辐射增敏性的影响；分别采用流式细胞仪和Hoechst 33258荧光染色法对辐照后细胞周期以及凋亡情况进行检测；Western blot法检测细胞损伤、修复及凋亡相关蛋白表达水平的变化；应用Real-time fluorescent quantitative PCR技术检测细胞内端粒酶活性；激光共聚焦显微镜观察γ-H2AX、XRCC4和Rad51在细胞内的分布及数量,衡量DNA损伤程度及修复情况；利用靶向性探针JC-1对线粒体的膜电势丢失情况进行检测。结果：1.MTT法的结果显示MST-312对HepG2细胞增殖抑制作用呈剂量依赖性,4 μM的MST-312对HepG2细胞的增殖抑制率较小,而且对细胞的形态没有明显影响；克隆形成实验结果显示,药物+辐照组的克隆形成率较单独辐照组明显降低；经流式细胞术分析,辐照后12 h能够引起显著G2/M期阻滞,但随着时间延长至24 h,与单独辐照组相比,药物+辐照中阻滞于G2/M期的细胞比例下降、同时Sub-G1细胞比例上升；Hoechst 33258荧光染色表明,在辐照后24 h,与单独辐照组相比,药物+辐照组中HepG2细胞出现了更加明显的凋亡形态变化；除此之外,辐照后24 h,药物+辐照组γ-H2AX蛋白表达量高于单独辐照组,此结果提示DNA损伤严重,未完全修复。2.通过Real-time fluorescent quantitative PCR分析得出,2 Gy的X射线上调hTERT的1nRNA表达,而MST-312能够有效地抑制HepG2细胞的内在和辐射诱导的hTERT的mRNA表达,即端粒酶活性；激光共聚焦显微镜观察到MST-312与X射线联合处理的细胞中存在着大量的γ-H2AX焦点,但同源重组修复(homologous recombination repair, HR)蛋白Rad51焦点被大量聚集在细胞核外；JC-1结果显示,与单独辐照组相比,药物+辐照组细胞内绿色荧光强度/红色荧光强度的比值升高,线粒体膜电势△ψm损失更为严重；Western blot的结果显示,与单独辐照组相比,药物+辐照组的p53蛋白表达增加、Bcl-2/Bax比值和caspase-3蛋白酶原表达量都有所降低。结论：端粒酶抑制剂MST-312对人肝癌HepG2细胞具有显著的辐射增敏作用；增敏作用机制与MST-312抑制端粒酶活性而引起端粒酶功能异常和影响DSBs修复的HR途径有关；MST-312不仅增加了辐射诱导的DNA损伤,而且影响了损伤DNA的修复,使得HepG2细胞通过p53依赖的线粒体途径走向凋亡。
【关键词】：端粒 端粒酶抑制剂 X射线 辐射敏感性 DNA损伤修复
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第一章 引言10-20
• 1.1 端粒、端粒酶的结构及功能10-12
• 1.1.1 端粒的结构与功能10-11
• 1.1.2 端粒酶的结构与功能11-12
• 1.2 端粒、端粒酶与肿瘤细胞辐射敏感性12-14
• 1.2.1 端粒、端粒酶与肿瘤细胞的关系12-13
• 1.2.2 端粒、端粒酶与肿瘤细胞辐射敏感性13-14
• 1.3 端粒、端粒酶与细胞辐射损伤修复14-15
• 1.4 端粒酶抑制剂的种类及其在放疗中的应用15-20
• 1.4.1 端粒酶抑制剂的种类及作用机制15-18
• 1.4.2 端粒酶抑制剂在放疗中的应用18-20
• 第二章 端粒酶抑制剂MST-312对人肝癌HepG2细胞辐射敏感性的影响20-31
• 2.1 实验材料20-21
• 2.1.1 主要实验仪器20-21
• 2.1.2 主要实验试剂21
• 2.2 实验方法和步骤21-24
• 2.2.1 细胞培养及冻存21-22
• 2.2.2 辐照条件及实验分组22
• 2.2.3 MST-312的配制22
• 2.2.4 甲基偶氮唑蓝(MTT)实验22
• 2. 2.5克隆形成实验22-23
• 2.2.6 克隆形成实验23
• 2.2.7 Hoechst33258染色检测细胞凋亡情况23
• 2.2.8 Western blot检测γ-H2AX蛋白表达水平23
• 2.2.9 数据统计与分析23-24
• 2.3 结果24-28
• 2.3.1 MST-312对HepG2细胞的增殖抑制作用及周期分布影响24-25
• 2.3.2 MST-312降低X射线辐照后HepG2细胞的克隆形成率25
• 2.3.3 MST-312增加X射线辐照后HepG2细胞sub-G1期的比例25-26
• 2.3.4 MST-312促进X射线诱导的HepG2细胞凋亡26-27
• 2.3.5 MST-312增强X射线对HepG2细胞的DNA损伤27-28
• 2.4 讨论28-31
• 第三章 端粒酶抑制剂MST-312增强人肝癌HepG2细胞辐射敏感性的机制研究31-46
• 3.1 实验材料31-32
• 3.1.1 主要实验仪器31-32
• 3.1.2 主要实验试剂32
• 3.2 实验方法和步骤32-37
• 3.2.1 细胞复苏与培养32-33
• 3.2.2 辐照条件及实验分组33
• 3.2.3 Real-time Fluorescent Quantitative PCR检测端粒酶活性33-35
• 3.2.4 激光共聚焦检测DNA损伤修复蛋白35-36
• 3.2.5 Western blot检测蛋白表达水平36-37
• 3.2.6 JC-1检测线粒体膜电位37
• 3.2.7 数据统计与分析37
• 3.3 结果37-44
• 3.3.1 MST-312抑制HepG2细胞内在的和辐射诱导的端粒酶活性37-38
• 3.3.2 MST-312增加X射线辐射后HepG2细胞核内γ-H2AX焦点的形成38-39
• 3.3.3 MST-312影响X射线辐射后HepG2细胞的DSBs修复39-40
• 3.3.4 MST-312上调X射线辐射后HepG2细胞的p53蛋白表达水平40-41
• 3.3.5 MST-312降低X射线辐射后HepG2细胞的线粒体膜电位41-42
• 3.3.6 MST-312改变X射线辐照后HepG2细胞Bcl-2与Bax蛋白比值,及下调caspase-3蛋白表达42-44
• 3.4 讨论44-46
• 第四章 全文总结46-47
• 参考文献47-53
• 在校期间的研究成果53-54
• 致谢54

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 郭月凤;;端粒与辐射敏感性[J];辐射研究与辐射工艺学报;2006年03期

2 杨立娜;冉俊涛;张红;刘圆圆;张秋宁;高力英;王小虎;;重离子束治疗肿瘤临床研究[J];原子核物理评论;2013年02期

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本文编号：817073