PTEN在肝癌恶性进展过程中促进上皮间质转化的作用研究

发布时间：2017-09-11 04:28

  本文关键词：PTEN在肝癌恶性进展过程中促进上皮间质转化的作用研究

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【摘要】：【研究背景和目的】原发性肝癌主要存在两种组织类型:肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)和肝内胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC),其中肝细胞肝癌最常见,约占70%到85%[1]。肝炎病毒、酒精性肝病、黄曲霉毒素、吸烟、肥胖等被证明是肝癌发病的重要危险因素[2]。肝脏肿瘤的临床发生一般经历慢性肝炎,长期的慢性刺激或大范围急性病变发展成肝硬化,最终肝癌产生[1]。当前肝移植及手术切除等治疗方案均未明显改善患者预后,而且肝癌肝内和门脉转移对患者预后有重要影响[3]。肿瘤的发生发展是多种因素多阶段共同作用的结果[4],探索肝癌发生发展的机制,对于控制和治疗肝癌有十分重要的意义。PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10)是第十号染色体缺失的磷酸酶与张力蛋白类似物。在一些高度恶性肿瘤中常有PTEN缺失,如Cowden综合征(Cowden’s syndrome),又称多发性错构瘤综合征,它是PTEN胚系突变引起的常染色体遗传疾病[5]。PTEN具有蛋白磷酸酶和脂质磷酸酶活性,主要通过拮抗PI3K/AKT信号通路,调控多种生命过程[6],如细胞周期、细胞衰老、细胞黏附、极性、细胞骨架、染色体的完整性等[7]。同时也有大量文献报道PTEN在肿瘤恶性转化过程中起到了非常重要的作用[5]。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指由于各种因素的诱导,上皮细胞自身骨架结构改变,同时细胞间、细胞与基底膜间、细胞与细胞外基质之间联系也发生变化,获得间质细胞形态和特性的过程[8,9]。上皮间质转化在肿瘤恶性进展的过程中有十分重要的意义[10],有文献报道鼻咽癌细胞中,来源于EB病毒的miRNA EBV-miR-BART7-3p靶向抑癌基因PTEN,活化的PI3K/AKT/GSK-3β信号通路使核内Snail和β-catenin集聚促进EMT[11]。本课题组先前在探索PTEN肝癌中作用的过程中,发现肝癌中PTEN的表达并不因为其作为抑癌基因而减少,由此我们意图通过探讨PTEN在肝癌发生发展的过程中发挥作用的方式,以及其与EMT的关系,从而进一步为肝癌患者判断预后、评价转移风险及寻找肝癌治疗新靶点提供相关的实验和理论依据。【研究方法】1、通过蛋白免疫印迹法和实时定量PCR检测肝癌患者癌、癌旁、正常组织样品中PTEN的表达情况;并用免疫组织化学的方法,分析肝癌组织芯片中PTEN的表达。2、通过测序分析肝癌患者癌、正常组织以及肝癌细胞系中PTEN的突变情况;检索肿瘤基因组数据库(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库信息,对PTEN在肝癌中的突变情况进行横向和纵向比较。3、通过蛋白免疫印迹法检测肝癌细胞系中pten的表达水平以及emt相关蛋白的表达水平;通过cck8增殖、迁移及侵袭实验比较不同亚群肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力;在低糖培养基下,观察不同亚群细胞的耐受能力。4、建立干扰pten稳转细胞系,并用蛋白免疫印迹、rt-pcr检测干扰效果及其对于细胞emt状态的影响;评估细胞增殖、迁移、侵袭能力的变化。5、通过蛋白免疫印迹法观察肝癌细胞系中过表达pten后,细胞emt相关蛋白标志的变化;比较过表达pten对于细胞增殖、迁移、侵袭能力影响。6、使用tgf-β诱导肝癌细胞系发生emt,利用蛋白免疫印迹法及实时定量pcr观察诱导效果。7、使用tgf-β诱导干扰pten肝癌细胞系发生emt,利用蛋白免疫印迹法及实时定量pcr观察诱导效果。8、使用双荧光素酶报告基因系统,研究pten对于e-cadherin转录活性的影响。9、肝特异性敲除pten小鼠,使用den联合ccl4的方案进行诱癌,体内试验研究pten对于在肿瘤发生发展的作用。10、肝特异性敲除pten小鼠与k-ras激活突变小鼠杂交,观察小鼠生长。【研究结果】1、尽管pten作为抑癌基因,但是其在肝癌组织中的表达水平相较于癌旁和正常组织并不低。转录水平也证明癌中pten的表达要高于相应的癌旁和正常组织。组织芯片结果显示肝癌组织中pten表达并不低。2、27对临床肝癌组织样本以及肝癌细胞中未检测到pten的突变。检索tcga数据库,liverhepatocellularcarcinoma(amc,hepatology2014)和liverhepatocellularcarcinoma(tcga,provisional)中,pten突变分别为2%和7%。与其他种类的肿瘤纵向比较,突变水平很低。3、根据肝癌细胞系中emt相关标志蛋白的表达差异,分成以lo2、qsg-7701、smmc-7721、hcc-lm3、plc/ref/5、sk-hep-1为代表的m群,它们高表达vimentin;而e群细胞有hepg2、huh7、mhcc97h、mhcc97l、pvtt,它们高表达e-cadherin。m群细胞中pten的表达水平要明显高于e群细胞。m群的细胞增殖、迁移、侵袭能力总体上要比e群的细胞强,其生长更加依赖于葡萄糖。4、干扰pten,细胞内间质性相关指标如n-cadherin、vimentin在蛋白和rna水平均下调。同时,细胞的迁移和侵袭能力在干扰pten后要明显下降。5、上皮型huh7细胞随着pten腺病毒量的增加,转录因子snail的表达量升高,引起e-cadherin的下调,间质性标志vimentin表达上升。在间质型细胞smmc-7721,过表达PTEN,引起转录因子Snail上调的同时也促进了间质性指标N-cadherin、Vimentin的表达。而且这种作用随着PTEN过表达程度的增加,呈现出下降趋势,但仍维持在较高水平。SMMC-7721和Huh7细胞中过表达PTEN后:细胞的增殖能力呈现下降趋势;迁移能力在一定水平增加,超过一定程度出现减弱。6、TGFβ处理后,肝癌细胞PTEN的表达在蛋白水平上调。实时定量PCR也证明在转录水平,TGFβ的作用使细胞出现上皮间质转化,PTEN的表达上调。7、干扰PTEN背景下,TGFβ诱导细胞发生EMT的效应减弱。8、PTEN影响CDH1转录启动子区域转录活性;TGFβ促进PTEN启动子区转录活性。9、PTEN在肿瘤发生的早期具有抑癌作用。10、KPC小鼠自发生成胆管癌。【结论】在肝癌发生的早期,PTEN具有抑制肿瘤发生的作用。而在肝癌发生后,PTEN高表达促进上皮间质转化,低表达时肿瘤发生上皮间质转化能力相对降低。LSL-Kras~(G12D/+),PTEN~(flox/flox),Alb-cre小鼠可以作为一种新型的胆管癌模型。
【关键词】：肝癌 PTEN 上皮间质转化 转化生长因子β 肿瘤转移
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-9
• 英文缩略词表9-10
• 前言10-12
• 材料和方法12-28
• 实验结果28-40
• 一、PTEN在肝癌组织中的表达并未下调28-29
• 二、PTEN在肝癌中的突变率很低29-30
• 三、根据EMT相关蛋白，肝癌细胞可以分成E群和M群30-32
• 四、干扰肝癌细胞PTEN的表达对于上皮和间质指标的影响32-34
• 五、在肝癌细胞系中过表达PTEN促进细胞向间质型转化34-35
• 六、TGF-β 诱导肝癌细胞系发生EMT，，细胞PTEN表达量增加35-36
• 七、干扰PTEN背景下，TGF-β 诱导细胞发生EMT的效应减弱36
• 八、PTEN影响CDH1转录启动子区域转录活性36-37
• 九、PTEN在肿瘤发生的早期发挥抑癌作用37-38
• 十、KPC小鼠能够自发生成胆管癌38-40
• 讨论40-43
• 参考文献43-48
• 附录48-49
• 综述 上皮间质转化与肿瘤的关系研究进展49-60
• 参考文献55-60
• 在读期间发表的文章60-61
• 致谢61-62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 Run-Long Lin;Lu-Jun Zhao;;Mechanistic basis and clinical relevance of the role of transforming growth factor-β in cancer[J];Cancer Biology & Medicine;2015年04期

2 Andrea Martini;Andrea Gallotta;Patrizia Pontisso;Giorgio Fassina;;Clinical applications of squamous cell carcinoma antigenimmunoglobulins M to monitor chronic hepatitis C[J];World Journal of Hepatology;2015年29期

3 ;Expression of PTEN,PPM1A and P-Smad2 in hepatocellular carcinomas and adjacent liver tissues[J];World Journal of Gastroenterology;2007年34期

4 Miriam J Alter;;Epidemiology of hepatitis C virus infection[J];World Journal of Gastroenterology;2007年17期

5 Masami Minagawa;Masatoshi Makuuchi;;Treatment of hepatocellular carcinoma accompanied by portal vein tumor thrombus[J];World Journal of Gastroenterology;2006年47期

本文编号：828634