miR-21调节乳腺癌细胞增殖的DNA甲基化机制研究
本文关键词：miR-21调节乳腺癌细胞增殖的DNA甲基化机制研究
更多相关文章： 乳腺癌 微小RNA21 DNA甲基化 联合作用 细胞增殖
【摘要】：目的微小RNA 21(miR-21)与DNA甲基化在乳腺癌发生过程中均发挥重要作用,与癌细胞增殖密切相关。然而二者在乳腺癌中的相互调节关系则知之甚少。因此本研究首先以探究乳腺癌细胞中miR-21与DNA甲基化的相互调节作用为切入点,进一步通过调节miR-21的表达及DNA甲基化水平研究二者在乳腺癌增殖中的联合作用。方法以LV3为载体,病毒包装miR-21抑制剂及其阴性对照序列感染MCF-7、MDA-MB-231细胞,使用荧光显微镜观察其转染效率及Real-time PCR检测miR-21表达的抑制率,接以bisulfite-qMSP检测基因组DNA甲基化水平,并以Real-time PCR及Western blot分别对DNA甲基化转移酶Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b的RNA和蛋白表达水平以及RAS通路中的重要分子H-RAS、RASGRP1进行检测。反之,以2.5μM DNA甲基化酶抑制剂5-Aza处理细胞72小时,观察DNA甲基化改变对miR-21表达水平的影响。以BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)法检测miR-21抑制剂与5-Aza在乳腺癌细胞增殖中的联合作用,并以流式细胞仪对细胞周期及细胞凋亡进行检测。结果荧光显微镜观察结果显示,LV3-AS-miR-21及LV3-NC均能有效感染细胞,LV3-AS-miR-21可显著敲低细胞内miR-21的表达水平(P0.05)。同时发现,敲低miR-21表达,可显著降低MCF-7(P0.05)细胞整体DNA甲基化水平,并引起转录水平上Dnmt1、Dnmt3a(P0.05)的升高及Dnmt3b的降低(P0.05)。而在MDA-MB-231细胞内则发现其整体DNA甲基化水平有所升高(P0.05),同时伴随有Dnmt1(P0.05)、Dnmt3a(P0.05)及Dnmt3b(P0.05)在RNA水平的表达升高。同时在对Dnmts蛋白水平的检测中发现,miR-21的低表达可引起MCF-7细胞内Dnmt3b蛋白水平的明显降低。相反的,其在MDA-MB-231细胞内的表达则显著升高。我们同时发现,敲低miR-21的表达,可明显降低MCF-7细胞内RASGRP1(P0.01)的表达水平,而在MDA-MB-231细胞中则可显著上调H-RAS(P0.01)及RASGRP1(P0.05)的表达水平。使用5-Aza处理细胞则发现,其在显著降低两种细胞基因组DNA甲基化水平(P0.01)的同时,可有效上调miR-21的表达水平(P0.01)。BrdU检测结果发现,甲基化酶抑制剂5-Aza可协同miR-21抑制剂进一步抑制MCF-7细胞的增殖(P0.01);而在MDA-MB-231细胞中发现,5-Aza的使用亦可进一步增强miR-21抑制剂对细胞增殖的抑制作用(P0.01)。进一步的细胞周期及凋亡检测发现,相对于单独处理,5-Aza与miR-21抑制剂联合使用可进一步加剧MCF-7细胞G1/S期阻滞并进一步降低周期调控蛋白Cyclin D1的蛋白表达水平。结论病毒介导的miR-21抑制剂对乳腺癌MCF-7与MDA-MB-231细胞DNA甲基化水平的调节截然相反,其中Dnmt3b发挥主要作用。这一过程可能有RAS信号通路的参与。而DNA甲基化的降低则可使两种细胞内miR-21的表达一致上调。与各自单独作用相比,DNA去甲基化可促进miR-21对乳腺癌细胞增殖的抑制作用,此抑制作用主要通过细胞周期调控蛋白Cyclin D1的表达改变所引起细胞周期发生改变而得以实现。本研究有助于深入了解乳腺癌的发生机制,并为日后临床上制定合理的乳腺癌治疗方案提供一定的实验依据。
【关键词】：乳腺癌 微小RNA21 DNA甲基化 联合作用 细胞增殖
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9
【目录】：
- 中文摘要4-6
- Abstract6-10
- 缩略语10-11
- 前言11-14
- 研究现状、成果11-13
- 研究目的和方法13-14
- 一、乳腺癌中miR-21与DNA甲基化的相互调控研究14-33
- 1.1 对象和方法14-27
- 1.1.1 材料14-17
- 1.1.2 实验方法及流程17-27
- 1.1.3 统计分析27
- 1.2 结果27-31
- 1.2.1 miR-21与DNA甲 基化基础水平在乳腺癌细胞MCF-7 与MDA-MB-231中呈现负相关27
- 1.2.2 敲低miR-21表达可引起乳腺癌细胞内DNA甲基化的改变27-30
- 1.2.3 miR-21可能通过RAS信号通路调节乳腺癌细胞内DNA甲基化水平30
- 1.2.4 甲基化酶抑制剂 5-Aza可显著上调乳腺癌细胞系中miR-21的表达30-31
- 1.3 讨论31-32
- 1.4 小结32-33
- 二、miR-21与DNA甲基化对乳腺癌细胞增殖中的联合作用研究33-45
- 2.1 对象和方法33-39
- 2.1.1 材料33-36
- 2.1.2 实验方法及流程36-38
- 2.1.3 统计分析38-39
- 2.2 结果39-43
- 2.2.1 miR-21与DNA甲基化对乳腺癌细胞增殖的影响39-41
- 2.2.2 miR-21与DNA甲基化对乳腺癌细胞周期的影响41-43
- 2.3 讨论43-44
- 2.4 小结44-45
- 结论45-46
- 参考文献46-50
- 发表论文和参加科研情况说明50-51
- 综述 miR-21与DNA甲基化在乳腺癌中的研究进展51-69
- 综述参考文献60-69
- 致谢69
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，本文编号：832000
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