自噬对肝癌HepG2细胞和正常肝L-02细胞作用的差异及相关分子机制

发布时间：2017-09-13 09:56

  本文关键词：自噬对肝癌HepG2细胞和正常肝L-02细胞作用的差异及相关分子机制

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【摘要】：背景:肿瘤在当今世界的全球死亡原因中位居第二位。原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)恶性程度高,发展迅速,容易复发的特点,使大部分患者在就诊时已经是晚期,失去了手术的最佳时机,而且肝癌对化疗亦不敏感。故只有通过对于癌症的发生及其发展机制的不断深入研究,才能取得更有效的预防和治疗方法。在内质网腔内,由各种原因引起的蛋白质错误折叠及错误折叠的蛋白质的积累,被称为内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)。内质网应激刺激过强,除了可以导致细胞经凋亡途径死亡外,还可以经II型程序性死亡方式-自噬。自噬是由基因调控并在进化上保守的介导的细胞自我消化的途径,充当肿瘤发生的动态监管机制。自噬对细胞的分化和发育起至关重要的作用,它是细胞对恶劣环境及压力的一种反应,但其对细胞生存的意义并不清楚。ERS的发生可导致细胞凋亡。BCL-2是从人类复发性滤泡性淋巴瘤染色体易位的断点区被确定的凋亡基因。Bcl-2家族蛋白不仅参与I型程序性细胞死亡(即凋亡),还参与了II型程序性死亡(即自噬)的调控。细胞自噬可防止抗肿瘤药诱导的凋亡,促进肿瘤耐药。然而,自噬性细胞死亡可能是凋亡耐受肿瘤细胞的一种死亡方式。本实验主要探索在ERS状态下,自噬对肝癌Hep G2细胞及肝正常L-02细胞作用的差异,及通过对Bcl-2基因的研究,了解凋亡与自噬的关系,以期能够为提高肝癌治疗效果寻找新的策略。第一部分观察自噬抑制剂在内质网应激状态下对肝癌Hep G2细胞和正常肝L-02细胞作用的差异目的:观察自噬在内质网应激(ERS)状态下对肝癌Hep G2细胞和正常肝细胞L-02作用的差异。方法:体外常规培养的人肝癌Hep G2细胞和正常肝L-02细胞,分别给予衣霉素(TM)单药和TM联合自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(TM+3-MA)或氯喹(TM+CQ)作用12、24、48 h后,采用MTT法检测细胞活力变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot法检测自噬蛋白LC3、抗凋亡蛋白Bcl-2的变化。结果:TM可引起Hep G2细胞和L-02细胞死亡并呈时间依赖关系,3-MA或CQ均可增加TM对Hep G2细胞的生长抑制作用,24 h细胞存活率分别为TM+3-MA(60%)、TM+CQ(72%)、TM(86%),差异有统计学意义(P0.01);但对于L-02细胞,其存活率分别为83%、84%、83%,活力没有明显差异;Annexin V/PI凋亡实验显示TM+3-MA、TM+CQ和TM组对Hep G2细胞的凋亡率分别为15%、11%和7%,差异有统计学意义(P0.01),但对L-02细胞组,凋亡率分别为16%、17%、16%,未见明显差别;免疫印迹结果显示TM引起自噬增加,自噬抑制剂3-MA与CQ可引起两种细胞自噬作用减弱;同时,在Hep G2细胞中,加入自噬抑制剂后,Bcl-2基因表达下调,而在L-02细胞中,Bcl-2基因低表达且未见明显变化。结论:自噬抑制剂(或3-MA或CQ)均可显著增加TM对肝癌Hep G2细胞的生长抑制,但对正常肝L-02细胞的生长抑制作用差异无统计学意义;在Hep G2细胞中,加入自噬抑制剂后,Bcl-2基因表达下调,而在L-02中未见明显差异。因此,可以认为自噬在ERS状态下可对癌细胞的生存提供保护,但对正常细胞无保护作用;同时,Bcl-2基因或是导致这一差异的分子机制之一。第二部分初步探讨Bcl-2基因或是自噬对肝癌Hep G2细胞提供生存保护的分子机制之一目的:研究在ERS状态下,因Bcl-2基因在肝癌Hep G2细胞和正常肝细胞L-02中表达的差异,导致自噬可为肝癌Hep G2细胞提供生存保护。方法:体外常规培养人肝癌Hep G2细胞和正常肝L-02细胞,给以Bcl-2的si RNA敲除Bcl-2基因,设空白对照组,NC+TM组,si RNA+TM组,单药TM组分别作用24h后,采用MTT法检测细胞活力变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot法检测抗调亡蛋白Bcl-2的变化。结果:转染si RNA下调Bcl-2的基因后,MTT结果显示:Hep G2细胞中,si RNA+TM组细胞存活率为70%,较TM单药组细胞存活率(88%)显著下降,差异有显著统计学意义(P0.01);L-02细胞组中si RNA+TM组细胞存活率为86%,与TM单药组细胞存活率(81%)相比,差异无统计学意义。流式结果显示:si RNA+TM组作用Hep G2细胞24 h后,Hep G2细胞凋亡率(11.17%)显著高于TM组(7.78%),差异有显著统计学意义(P0.01);而L-02组24 h,各实验组间凋亡率(NC:19.60%、si RNA+TM:19.45%、TM:19.89%)未见明显差异。Western blot法检测显示:Hep G2细胞组中,转染组Bcl-2/actin的灰度比值较TM单药组显著下降,差异具有统计学意义(P0.01);而L-02细胞组中,几乎未见Bcl-2蛋白的表达。结论:在TM诱导ERS状态作用下,用si RNA下调Bcl-2基因可明显增加Hep G2细胞的生长抑制率,但对正常肝细胞L-02的生长抑制无统计学意义。因此,可以认为Bcl-2基因在肝癌Hep G2细胞和正常肝细胞L-02中存在差异,且这种差异是自噬对肝癌Hep G2细胞提供生存保护的分子机制之一。
【关键词】：自噬抑制剂 内质网应激 肝癌 肝正常细胞 Bcl-2-siRNA 内质网应激 肝癌 肝正常细胞
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
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本文编号：843007