PSMD4在肝癌细胞中的表达及作用的研究

发布时间：2017-09-16 01:33

  本文关键词：PSMD4在肝癌细胞中的表达及作用的研究

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【摘要】：目的:肝细胞癌(hepatocellμlar carcinoma,HCC)是一种进展速度很快的恶性肿瘤,在恶性肿瘤死因中占第3位。尽管手术治疗和肝移植是目前治疗肝癌的第一选择,但是也只适用于15%-25%的病人,绝大多数病人仍难免死于肿瘤的复发和转移。目前第二可行的治疗方案还是化学疗法,不幸的是由于化疗所带来的毒性导致治疗效果并不理想。因此,探索研究新的基因功能改变与肝细胞癌发生发展及其恶性特征的关系,对揭示其发生发展的分子机制、设计合理的治疗方案及判断预后有重要的意义。泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system)被认为是一条重要的蛋白质降解途径,该系统在细胞周期,细胞分化与细胞凋亡等生物学行为中起重要的调节作用。26S蛋白酶体是该系统的主要组成部分,由2个19S和1个20S亚单位组成的桶状结构,20S为催化亚单位,19S为调节亚单位具有一种去泛素化的同功肽酶,使底物去泛素化而导致蛋白质的降解。PSMD4(Proteasome 26S subunit,non.ATPase)基因编码的蛋白是人26S蛋白酶体非ATP酶亚基4,内在的子单元19S为调节亚单位可以绑定泛素而参与底物识别,从而导致目标蛋白质的选择性降解。然而,PSMD4的表达与肝癌之间的关系尚不清楚。本研究的目的是利用临床标本和细胞模型,探测PSMD4在人类肝癌组织中的表达情况,以及对肝癌细胞恶性表型的影响。从而为PSMD4是否可以代表一个有价值的肝癌标记物和治疗靶点提供依据。方法:通过Real-time PCR和免疫组织化学方法检测PSMD4在肝癌组织的表达;细胞免疫荧光染色分析检测PSMD4的表达量;转染靶向PSMD4的sh RNA敲低内源性PSMD4表达;检测KLF4蛋白表达MTT和集落形成分析PSMD4对细胞生长的影响;通过沉默表达PSMD4的细胞模型检测其在体外的致瘤性。结果:1抗体的测试及PSMD4在肝癌细胞内的亚定位首先我们构建了两种质粒DNA,并且通过质粒瞬时转染后用western方法检测到PSMD4蛋白都有不同程度的过表达,证明构建的PSMD4质粒很成功,也验证了PSMD4的抗体效能很好。然后我们用免疫荧光的方法检测PSMD4的表达在细胞中的定位。PSMD4原始表达主要集中在细胞核和细胞质中,而过表达的PSMD4则主要集中在了细胞核中。2在临床肝癌样本中PSMD4的表达上调为了检测PSMD4在肝癌中的表达情况,同过Real-time PCR的方法,检测了PSMD4 m RNA的表达情况。按病理分期分成了四组,相对正常组,肝硬化组,高分化组和低分化组。结果显示,PSMD4在肝癌组中的表达高于相对正常组和肝硬化组,而相对于正常组与肝硬化组,高分化组和低分化组之间没有统计学差异。我们进一步检测了PSMD4在蛋白质水平上的表达,Western结果显示在随即检测的8组样本中有75%肝癌样本明显高于相对应的癌旁组织。此外,免疫组化的结果显示PSMD4在肝癌区域的表达高于旁边的高分化或相对正常区域。3过表达PSMD4促进肝癌细胞克隆的形成为了深入研究PSMD4在肝癌中的生物学作用,通过Western的方法检测了PSMD4在肝癌细胞系中的表达。结果显示,几乎所有的肝癌细胞系中PSMD4都呈高表达的状态。为进一步探究过表达PSMD4是否调节肿瘤细胞的生长,我们在HLK3中建立了PSMD4稳定过表达的细胞系和空载体对照组。然后检测了PSMD4对克隆形成能力的影响。在HLK3细胞系中,分别转染PSMD4质粒和相对照的空质粒,经过两周的G418药物的筛选,结果显示,PSMD4组的克隆形成在数量及大小上明显多于对照组,并且结果具有显著性差异(P0.05)。在SH-J1中的验证也得到了相同的结果。以上的结果表明,过表达PSMD4可以增强肝癌细胞克隆形成的能力。4沉默PSMD4抑制体外肿瘤的形成通过构建shRNA干扰PSMD4的慢病毒,并建立了干扰PSMD4及对照的肝癌细胞系(SK-Hep1和Huh7)。MTT增殖实验检测了稳定干扰PSMD4表达的SK-Hep1和Huh7两个肝癌细胞系后,与对照细胞系相比,干扰组的细胞增殖受到了明显的抑制。进一步检测稳定干扰PSMD4表达后对肝癌恶性生物学行为的影响。结果显示,在干扰PSMD4之后,克隆的形成能力明显受到了抑制。软琼脂克隆形成实验显示,干扰组细胞的体外成瘤形成能力受到了显著的抑制。以上结果提示,PSMD4影响了肝癌细胞在体外的增殖和克隆形成的能力。结论:1抗体的测试及PSMD4在肝癌细胞内的亚定位。2在临床肝癌样本中PSMD4的表达上调。3过表达PSMD4促进肝癌细胞克隆的形成。4沉默PSMD4抑制体外肿瘤的形成。
【关键词】：PSMD4 肝细胞癌 肿瘤生长 致瘤性
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 前言11-13
• 材料与方法13-23
• 结果23-26
• 附图26-31
• 讨论31-32
• 结论32
• 参考文献32-35
• 综述 26S蛋白酶体复合物的功能概述35-41
• 参考文献37-41
• 致谢41-42
• 个人简历42

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1 冯海斌;PSMD4在肝癌细胞中的表达及作用的研究[D];河北医科大学;2015年

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本文编号：860125