piRNA-823：一种新型非编码小RNA在结直肠癌中的促肿瘤生成作用

发布时间：2017-09-17 17:35

  本文关键词：piRNA-823：一种新型非编码小RNA在结直肠癌中的促肿瘤生成作用

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【摘要】：DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)的催化下,将S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)的甲基转移到特定碱基上的过程。DNMT分为两类:一类是持续性甲基转移酶DNMT 1,主要参与DNA复制过程中新合成链的甲基化;另一类是从头甲基转移酶,包括DNMT 3A和DNMT 3B,主要介导Cp G位点甲基化,通过表观遗传学机制调控细胞生长分化。DNA甲基化参与了基因组印记、X染色体失活以及重复元件抑制过程,为正常发育所必需。近年来研究发现,DNA甲基化异常可导致原癌基因激活以及抑癌基因失活,从而导致癌症的发生。结直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一,其发生涉及基因突变及表观遗传学改变。其中表观遗传学改变更为常见,且影响着数百个肿瘤相关基因。DNA甲基化异常是最主要的表观遗传学改变,包括总体基因的低甲基化和特定区域的高甲基化,前者可导致原癌基因激活,后者主要发生在启动子区域的Cp G岛,可导致抑癌基因失活,这两种甲基化异常在散发性结肠癌发生中起着重要作用。Piwi蛋白相互作用RNAs(Piwi-interacting RNAs,pi RNAs)是近年来新发现的一类非编码小RNAs。其仅仅与Argonaute蛋白家族的piwi亚家族蛋白结合,而不与Ago亚家族蛋白结合,因此被命名为pi RNAs。最初,pi RNAs被认为仅存在于生殖干细胞中,通过DNA甲基化沉默转座子来维持基因组的完整性,从而在生殖干细胞中发挥着表观遗传调控作用。最近,在多种癌细胞中发现了pi RNAs的异常表达,如胃癌、宫颈癌、乳腺癌和膀胱癌等等,且大量证据均表明,癌细胞与干细胞具有相似的表观遗传信号,这暗示,pi RNAs可能在癌症的发生中也发挥着相似的表观遗传调控作用。pi RNA-823为pi RNAs成员之一,在不同类型的肿瘤中其表达及作用不同。在胃癌中pi RNA-823表达降低,但在多发性骨髓瘤中其表达升高,并增加了从头甲基化水平,然而,pi RNA-823在结直肠癌中的功能尚不明确。本课题旨在研究pi RNA-823在结直肠癌中的表达及其对结肠癌细胞系HCT 116增殖、凋亡及克隆形成能力的影响,并进一步探讨其在结直肠癌表观遗传调控中的功能,为开发以pi RNAs为靶点的结直肠癌治疗提供理论依据。目的:研究pi RNA-823在结直肠癌中的表达及其对结肠癌细胞系HCT 116生物学行为的影响,并进一步探讨其对DNA甲基转移酶表达的影响。方法:从河北医科大学第二医院收集14对手术切除的新鲜结直肠癌及其癌旁组织标本用于实验。应用real time RT-PCR检测pi RNA-823在结直肠癌及其癌旁组织中的表达差异,并进一步应用结肠癌细胞系HCT 116研究pi RNA-823在结直肠癌中的功能。在HCT 116细胞中转染pi RNA-823的抑制剂pi RNA-823 antagomir,通过real time RT-PCR观察转染效率。应用CCK-8实验检测细胞增殖情况,应用流式细胞术观察细胞周期变化,Annexin V/PI双染及TUNEL技术检测细胞凋亡情况,并进一步应用western blot检测凋亡相关蛋白(caspase-8、caspase-9和caspase-3)的活性。最后,为了解pi RNA-823与DNA甲基化的关系,应用western blot观察其对DNMT 1、DNMT 3A、DNMT 3B表达的影响。结果:①Real time RT-PCR结果显示,pi RNA-823在结直肠癌组织中的表达明显高于其配对的癌旁组织(P0.05),并且以癌旁组织为对照,结肠癌细胞系HCT 116中pi RNA-823的表达也升高(P0.001)。②CCK-8实验结果显示,三种不同浓度的pi RNA-823的抑制剂pi RNA-823antagomir(10 nmol/L、30 nmol/L、100 nmol/L)能明显抑制HCT 116增殖(P0.05),且呈现出剂量依赖性。③Real time RT-PCR结果显示,在转染后48 h,100 nmol/L的pi RNA-823 antagomir能有效下调pi RNA-823的表达(P0.05)。④流式细胞术结果显示,抑制pi RNA-823表达后,G1期的细胞数明显增多(P0.001),而S期和G2/M期的细胞数则相应下降(P0.01),表明抑制pi RNA-823可以将HCT 116细胞阻滞在G1期,抑制G1/S期转换。⑤Annexin V/PI双染结果显示,抑制pi RNA-823可导致凋亡细胞比例明显升高(P0.001);TUNEL染色结果显示,抑制pi RNA-823后,TUNEL染色阳性细胞率明显升高(P0.001);Western blot结果显示,抑制pi RNA-823可提高caspase-8、caspase-9及caspase-3的活性(P0.01)。以上结果表明,抑制pi RNA-823可促进HCT 116细胞凋亡。⑥平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验均显示,抑制pi RNA-823表达后,HCT 116细胞克隆形成能力明显降低(P0.01)。⑦Western blot结果显示,抑制pi RNA-823可下调DNMT 3A和DNMT 3B的表达(P0.05),而对DNMT 1的表达没有明显影响(P=0.88),表明pi RNA-823可能通过调节从头DNA甲基化水平参与结直肠癌发生。结论:pi RNA-823通过调节从头DNA甲基转移酶DNMT 3A和DNMT3B的表达,促进结肠癌细胞凋亡,抑制其增殖,从而参与结直肠癌的发生。pi RNA-823有望成为结直肠癌治疗的新靶点。
【关键词】：结直肠癌 piRNAs piRNA-823 DNA甲基化 表观遗传调控
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.34
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文缩写11-12
• 前言12-13
• 材料与方法13-27
• 结果27-30
• 附图30-38
• 附表38-41
• 讨论41-43
• 结论43
• 参考文献43-47
• 综述 piRNA-piwi通路在癌症表观遗传学中的功能47-61
• 参考文献55-61
• 致谢61-62
• 个人简历62

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本文编号：870779