雷公藤红素在去势抵抗型前列腺癌中潜在应用的研究

发布时间：2017-09-17 23:23

  本文关键词：雷公藤红素在去势抵抗型前列腺癌中潜在应用的研究

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【摘要】：前列腺癌(Prostate Cancer,PC)是严重威胁男性健康的重大疾病之一。美国癌症学会每年发布的全国卫生统计数据显示,男性PC的死亡率仅次于肺癌及支气管癌,连续高居各年龄段男性癌症患者死亡率的第二位。雄激素(Androgen)及其受体(Androgen Receptor,AR)在前列腺癌的发生与演进过程中发挥重要作用,因此,通过手术或药物去势抑制AR转录活性的雄激素剥夺治疗(Androgen Deprivation Therapy,ADT)一直是前列腺癌治疗的标准方法。尽管雄激素被剥夺可以暂时延缓患者的生存期,但大部分患者会在几年内发生癌症复发,发展为浸润性更强的前列腺癌,即去势抵抗性前列腺癌(Castration Resistant Prostate Cancer,CRPC)。AR基因包含8个外显子和7个内含子,全长约90kb,编码约919个氨基酸残基,一般由四个结构域组成。其中NTD(N-Terminus domain)为外显子A编码的低保守的氨基端结构域,又称转录激活域(transcription activate domain,TAD)。DBD(DNA-binding domain)为一个相对较小的结构域。此区域包括3个α螺旋组成的两个锌指结构。AR的DBD区与其他类固醇受体的结合区域具有高度的同族性,通过此区AR识别并结合ARE,结合后的受体/激素复合物便可刺激转录起始位点附近的起始前复合物形成同时使该复合物稳定,进而将其与RNA聚合酶Ⅱ连接,活化信息核糖核酸mRNA的转录。LBD(ligand binding domain)与DBD区之间由一个含有核定位信号的铰链区(flexible hinge)相连,主要功能为决定配体/受体之间的特异性结合,同时LBD区与NTD区为两个完成AR活化调节转录的两个主要结构域。除此之外,LBD区还包含与热休克蛋白(heat shock protein,HSP)相互作用区,二聚体化区域以及一个转录激活功能区AF2(activation function 2)。在体内没有雄激素存在时,LBD区一般与不同分子量的HSP等分子伴侣结合,使构象维持在一种激素高亲和状态,以寡聚体的形式存在于胞浆中,此时AR不具有转录活性。一旦AR与雄激素结合后,其空间构象就发生了改变,同时与HSP解离,进一步磷酸化,进而使其与DNA的亲和力增高,发生AR的活化。活化以后的AR头头尾尾相接,形成同源二聚体,然后进入靶细胞核,与靶基因启动子中特定的DNA序列——雄激素反应元件(androgen response element,ARE)相结合,再在TIF-2、CBP/p300、ARA70、ARA54、BAG-IL等共调节因子(coregulator)的作用下开启转录调控,激活一系列与细胞生长发育、自动平衡、生殖代谢等活动相关的靶基因,如前列腺特异性抗原(PSA)、SLP、probasin等基因的表达,进而发挥其生物学效应。这种ar的活化被称之为配体(激素)依赖性ar的活化(ligand-dependentactivation),还有研究表明,在没有发生基因突变的情况下,ar的活化还可以通过配体非依赖性(ligand-independentactivation)机制进行。可见,ar的转录调节功能对于引发靶基因的有效转录,指导特定蛋白质的合成及细胞的生长和分化具有重要意义。去势抵抗的形成源于ar被重新激活。在crpc中,ar仍持续高表达且有转录活性;利用crpc动物模型证实crpc的生长依赖于ar的重新激活;去势后crpc患者体内有雄激素残留,在crpc患者的肿瘤样品中发现高水平的与雄激素合成相关的酶,说明肿瘤细胞内可以合成雄激素。恩杂鲁胺(enzalutamide)和阿比特龙(abiraterone)是美国食品与药物管理局(fda)新批准的第二代雄激素/雄激素受体(ar)拮抗药物,分别抑制雄激素的合成及雄激素与受体的结合。abiraterone抑制雄激素合成必须的cyp17a1酶活性,enzalutamide是一种更有效的雄激素与ar结合的拮抗剂。以enzalutamide和abiraterone为代表的第二代荷尔蒙治疗药物进入了iii期临床试验。临床试验表明,去势抵抗性前列腺癌患者表达ar剪接变异体ar-v7。ar-v7由第3外显子变异剪接形成。由于ar-v7缺少lbd,使得恩杂鲁胺和阿比特龙作用脱靶,造成前列腺癌演进为转移型去势抵抗前列腺癌(mcrpc)。此外,arlbd的体细胞突变(f876l),使得enzalutamide的作用由雄激素拮抗转变为雄激素激活。以tok-001(galeterone)为代表的第三代雄激素剥夺治疗最近进入了临床试验,其作用不仅是雄激素拮抗,还引起ar降解,因此避免了因ar突变或变异剪接引起的抗药性。对恩杂鲁胺和阿比特龙不敏感的前列腺癌患者仍然对甾醇类抗雄激素药物galeterone有强烈反应,galeterone目前在临床iii期试验,是第一个在ar-v7阳性mcrpc患者用于精准治疗的雄激素剥夺药物。雷公藤红素(celastrol)是从传统中药雷公藤根部分离的三萜烯类化合物,其化学结构与tok-001相似,也作用于ar降解途径。与配体(激素)结合前,ar主要存在于细胞质中,与分子伴侣(热休克蛋白hsp90)结合形成异聚体。雷公藤红素能抑制hsp90的atp结合活性,或破坏hsp90分子伴侣复合物的形成,引起客户蛋白ar的不稳定。我们发现雷公藤红素作用于前列腺癌细胞引起蛋白酶calpain的激活,造成ar蛋白的切割降解。雷公藤红素在前列腺癌细胞和动物模型中清除ar蛋白,诱导肿瘤细胞凋亡和肿瘤生长抑制,对转移性crpc的生长抑制率达93%,显示良好的对crpc治疗的潜在应用。鉴于雷公藤红素能够引起ar蛋白的降解,其化学结构与gal相似,在本研究中我们探究了雷公藤红素对AR-V7阳性前列腺细胞的作用。与之前的研究相符,雷公藤红素能抑制AR蛋白表达,同时还能诱导22Rv1前列腺癌细胞AR-V7蛋白的表达下调。用5μmol/L雷公藤红素在不同时间下处理22RV1细胞。通过western blot检测了全长AR以及AR-V7的表达。结果显示,AR全长和AR-V7的表达均受到下调,并且呈现时间依赖特性。24小时药物处理后,全长AR以及AR-V7的表达完全消失。经过雷公藤红素处理后,AR-V7和全长AR在mRNA表达水平都没有降低,表明AR-V7的减少不是由于AR的翻译也不是由于AR-V7的拼接改变导致的。在雷公藤红素处理后通过Western blot对凋亡相关蛋白进行检测。结果显示,PARP、SpectrinαII以及Calpastatin蛋白均受到切割,同时在细胞形态上能够检测到膜皱缩等凋亡细胞特性。综上,我们确认了雷公藤红素能够抑制22Rv1细胞中AR-V7的表达,并且能够诱导细胞凋亡。抗雄激素药物能导致雄激素胞质定位,因此我们研究了雷红素处理后的AR-V7核转位。经过雷公藤红素处理后,我们检测了AR以及AR-V7的核转位。与AR不同,AR-V7定位在细胞核中,雷公藤红素处理并未引起AR-V7出核。从PARP以及SpectrinαII的切割、凋亡形态的改变可以证实,AR-V7的降解伴随着细胞和内凋亡蛋白的激活。PARP以及SpectrinαII的切割表明Caspase-3的激活。Caspase-3是凋亡的主要执行者,当细胞凋亡被caspase-3抑制剂z-VAD-FMK抑制时,AR-V7的降解也被抑制,这表明了caspase-3促进了雷公藤红素诱导的AR-V7降解。Western blot以及活性检测实验都证实了z-VAD-FMK有效抑制caspase-3活性。另外,雷公藤红素诱导的细胞形态改变也能够被z-VAD-FMK抑制。这些结果均表明,雷公藤红素诱导的凋亡对雷公藤红素诱导的AR-V7降解至关重要。我们的研究结果表明了雷公藤红素能够诱导AR-V7的降解,可以克服临床应用的雄激素拮抗剂的脱靶效应,是一种潜在的用于AR-V7阳性前列腺癌患者的治疗手段。
【关键词】：雄激素受体 雄激素受体剪接变异体-7 雷公藤红素 细胞凋亡
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.25
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-10
• Chapter 1 Introduction10-21
• 1.1 Research origin10
• 1.2 Research purpose and significance of subject10-11
• 1.3 Background11-19
• 1.3.1 Development of Prostate Cancer11-13
• 1.3.2 Androgen/androgen receptor signaling13-15
• 1.3.3 AR splice variants15-16
• 1.3.4 Treatment of prostate cancer16-17
• 1.3.5 Celastrol potential implications for prostate cancer treatment17-19
• 1.4 Research route19-21
• Chapter 2 Materials and Methods21-27
• 2.1. Materials and Reagents21-22
• 2.1.1 Materials21
• 2.1.2 Reagents21
• 2.1.3. Polyacrylamide gel composition21
• 2.1.4 Solution21-22
• 2.1.5 Devices used in this study and its manufacturer established22
• 2.2. Methods22-27
• 2.2.1. Culture media22-23
• 2.2.2. Cell culture23
• 2.2.3. Maintenance of cells23
• 2.2.4 RNA Isolation23-24
• 2.2.5 Real-time quantitative reverse transcription-PCR24-25
• 2.2.6 Protein Extraction25
• 2.2.7. Western blot25-27
• Chapter 3 Effects of Celastrol on AR-V7 depletion27-33
• 3.1. Celastrol induced AR-V7 decrease in 22Rv1 cell27-29
• 3.1.1 AR-V7 levels analyzed by Western Blotting27-28
• 3.1.2 AR-V7 mRNA expression28-29
• 3.2 Apoptotic effects of celastrol in 22Rv1 cells29-31
• 3.3 Morphological changes after Celastrol treatment31-32
• 3.4. Summary32-33
• Chapter 4 Effects of cholesterol on AR-V7 translocation33-35
• 4.1. AR-V7 nucleus and cytosol translocation33
• 4.2. Apoptotic effects in nucleus33-34
• 4.3. Summary34-35
• Chapter 5 Mechanisms of Celastrol-induced AR-V7 loss35-37
• 5.1 Caspase-3 effects of AR-V7 loss (Evaluation on apoptotic)35-36
• 5.2. Summary36-37
• Conclusions37-38
• References38-44
• Acknowledgements44

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本文编号：872002