改良型人NK细胞体外扩增技术建立及CAR-NK细胞治疗技术初步研究

发布时间：2017-09-19 17:33

  本文关键词：改良型人NK细胞体外扩增技术建立及CAR-NK细胞治疗技术初步研究

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【摘要】：NK细胞过继疗法是肿瘤免疫疗法的一种具有前景的治疗策略,然而,大量扩增具有功能的NK细胞方法的缺乏限制了它的发展。由于IL21分子是NK细胞功能的重要调节分子,因此本文的主要目的之一是建立一种改良型的基于IL21分子的NK细胞体外扩增技术。在本文中,我们在稳定表达IL15和CD137L分子的p APC细胞上再进一步表达IL21分子,然后用构建的该工程细胞株(命名为p APCNK)来扩增NK细胞。具体方法为:分离4名健康人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),采用工程细胞p APCNK并补充细胞因子IL2对NK细胞进行体外扩增,应用细胞计数法和流式细胞术分别比较NK细胞的扩增倍数和NK细胞纯度,并采用CFSE/7-AAD法对肿瘤细胞K562和RPMI-8226进行细胞毒性试验检测杀伤效率。经过三周的刺激培养,NK细胞平均扩增至409.4倍,细胞纯度由最初的低于20%提高到90%以上。杀伤实验结果显示,扩增的NK细胞对K562细胞杀伤率高达85.2%。但由于NK细胞非抗原特异性的杀伤特征,会限制其临床上的治疗效果。近年来过继性细胞治疗技术中,嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)修饰的T细胞技术异军突起,在体外和临床试验中表现出良好的靶向性、杀伤性和持久性,展示了巨大的应用潜力和发展前景。因此本研究在NK细胞扩增技术体系建立的基础上,尝试开发CAR-NK细胞治疗技术,从而提高NK细胞活性并且让NK细胞具备肿瘤抗原特异性杀伤能力。本研究选用HER2作为靶点来探索开发CAR-NK细胞治疗技术的可能性,并积累了初步的实验数据,为进一步建立完善的CAR-NK细胞治疗技术提供了依据。
【关键词】：NK细胞 体外扩增 pAPCNK CAR-NK HER2-CAR-T 癌症免疫治疗
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.51
【目录】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-9
• 引言9-13
• 材料和方法13-22
• 2.1 实验材料13-14
• 2.1.1 标本及细胞系13
• 2.1.2 主要试剂与材料13
• 2.1.3 主要仪器与设备13-14
• 2.1.4 主要抗体14
• 2.2 实验方法14-22
• 2.2.1 细胞培养14
• 2.2.2 建立pAPC~(NK)细胞系14-18
• 2.2.2.1 mbIL21质粒构建14-18
• 2.2.2.2 慢病毒包装18
• 2.2.2.3 慢病毒转染pAPC细胞18
• 2.2.3 慢病毒浓缩18-19
• 2.2.4 慢病毒滴度测定19
• 2.2.5 分离并制备淋巴细胞单细胞悬液19-20
• 2.2.6 NK细胞体外激活20
• 2.2.7 表型分析(流式分析)20
• 2.2.8 慢病毒感染T/NK细胞20-21
• 2.2.9 细胞杀伤试验21
• 2.2.10 统计学分析21-22
• 结果22-34
• 3.1 IL21/p CDH-CMV-MCS-EF1-Cop GFP分子构建22-24
• 3.2 IL21/p CDH-CMV-MCS-EF1-Cop GFP慢病毒包装24
• 3.3 IL21/p CDH-CMV-MCS-EF1-Cop GFP慢病毒感染pAPC细胞24-25
• 3.4 不同浓度IL2对NK细胞扩增表型的影响25-26
• 3.5 不同浓度IL2对NK细胞扩增倍数的影响26
• 3.6 不同样本NK细胞体外扩增效率26-27
• 3.7 NK细胞对肿瘤细胞的杀伤效果27-28
• 3.8 CAR-T/CAR-NK技术建立28-34
• 3.8.1 HER2-CAR-pCDH重组质粒的构建28-30
• 3.8.2 HER2-CAR慢病毒的包装和测定30-31
• 3.8.3 HER2-CAR-T技术体系的建立31-33
• 3.8.4 HER2-CAR-NK技术体系的建立33-34
• 讨论34-37
• 参考文献37-43
• 综述43-57
• 参考文献50-57
• 硕士期间科研成果57-58
• 致谢58-60

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1 李亚芬;改良型人NK细胞体外扩增技术建立及CAR-NK细胞治疗技术初步研究[D];苏州大学;2015年

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本文编号：883006