microRNA-4754通过调节mTOR信号通路发挥在人胃癌细胞系SGC-7901中的抗肿瘤作用

发布时间：2017-09-20 07:35

  本文关键词：microRNA-4754通过调节mTOR信号通路发挥在人胃癌细胞系SGC-7901中的抗肿瘤作用

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【摘要】：背景与目的：胃癌是一类高度侵袭性的恶性肿瘤,属于我国最常见的恶性肿瘤,其死亡率位居世界第二位,是一类严重危害人类健康的疾病,其发生发展是多因素共同作用的结果。microRNA是一类内源性的不具有编码功能的小分子RNA,长度约为22个核苷酸左右。microRNA可通过特异性的互补结合靶基因的3’或5'非翻译端发挥调节作用,并可根据互补程度的不同来抑制其表达或使其降解。microRNA参与细胞的多种生物进程如：细胞增殖、分化、衰老和凋亡等。越来越多的研究发现在胃癌中存在着多种microRNA的表达异常,研究发现这些异常表达的microRNA可以通过调节多种途径影响肿瘤的发生、浸润、转移、对药物及放射治疗的敏感性及患者预后,大量的研究证明microRNA可作为胃癌早期诊断及估计治疗效果的生物标记。本研究结合本课题组之前研究结果,采用构建miR-4754高表达载体并转入人胃癌细胞系SGC-7901中来探究其对人胃癌细胞系SGC-7901的细胞活性、迁移、侵袭及细胞凋亡等的影响,并进一步探究其可能的作用机制,为研究microRNA-4754在人胃恶性肿瘤中的生物学作用提供了理论基础。方法：采用聚合酶链式反应检测microRNA-4754在六种胃癌细胞AGS, SGC-7901, BGC-823, NCI-N87, MKN-28, MGC-803中的表达量并筛选出表达量最低的一种细胞即SGC-7901,将构建的miR-4754过表达慢病毒载体转入SGC-7901细胞系中,再次采用PCR反应检测转染后的miR-4754的表达水平。采用Cell Counting Kit-8和克隆形成实验检测细胞活性,Transwell和划痕实验检测细胞迁移、侵袭能力,Flow Cytometry和Hoechst33342/PI荧光双染检测细胞凋亡,并通过western blot探究miR-4754可能的作用机制。实验分为三组,空白组：正常的SGC-7901细胞；对照组：转染空病毒的SGC-7901细胞；实验组：转染miR-4754过表达慢病毒的SGC-7901细胞。统计分析：采用Graphpad Prism5软件对结果进行统计学分析,计量资料采用均数士标准差(x土s)的形式表现,两组间均数的比较采用t检验,实验组和对照组之间均数的比较采用one-way ANOVA方法检验,p0.05认为差异具有统计学意义。结果：1.RT-PCR实验结果显示,在上述六种胃癌细胞中均可以检测到miR-4754的表达,其表达量在SGC-7901细胞系中最低；且转染microRNA-4754过表达慢病毒载体后其microRNA-4754的表达量明显升高；2. Cell Counting Kit-8细胞增殖实验以及细胞克隆形成实验结果显示,转染microRNA-4754过表达载体的SGC-7901细胞其增殖活性及克隆形成率较空白组及对照组相比明显降低,细胞活性明显受到抑制；3.Transwell实验结果证实,转染miR-4754过表达慢病毒载体的SGC-7901细胞中穿过小室基膜的细胞数目较对照组及空白组明显减少,说明细胞迁移及侵袭受到明显抑制；4.划痕实验结果证实,在相同密度下,经过同样的时间(48h),转染miR-4754过表达慢病毒载体的SGC-7901细胞向中央迁移的距离和对照组及空白组相比明显减少；6. Flow Cytometry检测细胞凋亡的结果表明在同样的培养条件下,转染miR-4754过表达慢病毒的SGC-7901细胞的凋亡率明显增加；7. Hoechst33342/PI荧光双染结果证实,在同样的培养条件下,转染miR-4754过表达慢病毒载体的SGC-7901细胞中,PI阳性的细胞比例较对照组及空白组明显增多,表明SGC-7901细胞在转染microRNA-4754过表达慢病毒载体后细胞凋亡率增高；8.Western Blot结果显示,在转染microRNA-4754过表达慢病毒载体的SGC-7901细胞中,其p-mTOR(磷酸化雷帕霉素靶蛋白)的表达量较空白组和对照组明显降低。结论：1.microRNA-4754过表达慢病毒构建成功且能够稳定转染人SGC-7901细胞,并能建立稳定的过表达miR-4754的SGC-7901细胞系；2. microRNA-4754可以抑制人胃癌细胞系SGC-7901的增殖、克隆形成、迁移、侵袭并且可以诱导细胞凋亡,即microRNA-4754可以在人胃癌细胞系SGC-7901中发挥抗癌作用；3. microRNA-4754可能通过抑制p-mTOR(磷酸化雷帕霉素靶蛋白)的表达发挥在人胃癌细胞系SGC-7901细胞中的抗肿瘤作用。
【关键词】：胃癌 SGC-7901细胞 microRNA-4754 细胞增殖及凋亡 雷帕霉素靶蛋白
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符号说明13-14
• 前言14-16
• 材料与方法16-31
• 结果31-34
• 讨论34-38
• 结论38-39
• 附图39-44
• 参考文献44-50
• 综述50-56
• 参考文献52-56
• 致谢56-57
• 发表论文57-58
• 学位论文评阅及答辩情况表58

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本文编号：886742