EMMPRIN在肺癌介导的抑制成骨分化过程中的作用及机制研究

发布时间：2017-09-20 16:26

  本文关键词：EMMPRIN在肺癌介导的抑制成骨分化过程中的作用及机制研究

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【摘要】：背景和目的:肺癌是当今全球癌症死亡的主要原因之一。根据生物学特点、治疗方式及预后等可将肺癌主要分为两大类:非小细胞肺癌与小细胞肺癌,其中以非小细胞肺癌为主。非小细胞肺癌占85%以上,而其中约30%-40%的非小细胞肺癌患者会发生骨转移。目前对于肺癌骨转移的机制研究并不清楚。研究比较深入的为“恶性循环”学说,一方面,转移至骨的肿瘤细胞表达、分泌众多细胞因子,作用于骨微环境,破坏了成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞介导的骨吸收之间的正常生理平衡;另一方面,骨质的破坏也会释放一系列因子,促进肿瘤细胞的生长、侵袭等。肺癌骨转移可导致一系列包括骨痛、病理性骨折、脊髓压迫和神经压迫症状等在内的严重并发症,降低患者的生活质量。细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(Extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN),又称CD147,是一种高度糖基化的跨膜糖蛋白,为免疫球蛋白超家族一员,能刺激多种基质金属蛋白酶(Matrix metallo proteinases,MMPs)的表达,促进肿瘤细胞侵袭及转移,并能够通过调控血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达,从而诱导肿瘤血管生成。业已证实,EMMPIN的高表达与乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤的预后密切相关。最近有文献报道通过上调EMMPRIN的表达,可加速“恶性循环”,激活破骨细胞,增强乳腺癌的溶骨性转移,但EMMPRIN对肺癌细胞介导的成骨细胞分化成熟是否起作用并不清楚。本研究旨在研究EMMPRIN在肺癌介导的抑制成骨分化中的作用及可能机制,为临床肺癌骨转移防治开辟新的思路。研究方法:我们采用EMMPRIN过表达、短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒感染非小细胞肺癌A549细胞,建立稳定的相应A549细胞系。首先,观察其对非小细胞肺癌A549细胞自身的增殖、迁移与侵袭等生物学行为的影响,并探讨其可能机制。而后,收集相应的肺癌细胞条件培养基(conditioned medium,CM),与成骨前体细胞mc3t3-e1共培养,观察其对成骨前体细胞mc3t3-e1成骨分化的影响。最后,我们检测其对肺癌a549细胞自身的dkk1的表达的影响,并进一步检测成骨前体细胞mc3t3-e1内wnt/β-catenin信号通路β-catenin活化的情况。一、emmprin对肺癌a549细胞增殖、迁移与侵袭的影响1.用shrna干扰emmprin表达的慢病毒、过表达emmprin的慢病毒及阴性对照(negativecontrol,nc)的慢病毒感染肺癌a549细胞,嘌呤霉素筛选。利用realtimepcr技术、western-blot蛋白印迹法分别检测各组细胞emmprin的mrna、蛋白表达情况。建立稳定emmprin过表达(a549emp)、干扰emmprin表达(a549shemp)和阴性对照a549nc细胞。采用cck-8实验、划痕实验及transwell小室法分别检测emmprin对肺癌a549细胞增殖、迁移与侵袭能力的影响。2.利用western-blot蛋白印迹法检测a549emp细胞、a549shemp细胞、a549nc细胞与空白对照a549细胞中的β-catenin核表达情况。二、emmprin在肺癌介导的抑制成骨分化中的作用机制研究收集a549emp细胞、a549shemp细胞、a549nc细胞与空白对照a549细胞条件培养基,以20%条件培养基的含量制备相应不同组成骨诱导培养基,并与成骨前体细胞mc3t3-e1共培养。1.利用bcip/nbt染色法检测相应各组mc3t3-e1细胞alp活性;2.利用茜素红s染色检测相应各组mc3t3-e1细胞骨结节矿化形成情况;3.利用realtimepcr技术检测相应各组mc3t3-e1细胞col1α1、runx2/cbfa1和ocnmrna的相对表达量;4.利用realtimepcr技术、western-blot蛋白印迹法及细胞免疫荧光法检测相应各组肺癌a549细胞dkk1表达的差异情况;5.利用western-blot蛋白印迹法检测相应各组mc3t3-e1细胞中的β-catenin核表达的差异情况。实验结果:一、emmprin对肺癌a549细胞增殖、迁移与侵袭能力的影响1.稳定的肺癌a549细胞系的成功建立与a549nc组、空白对照a549组相比,a549emp组细胞emmprin的mrna和蛋白表达水平均明显升高(p0.05),相反,a549shemp组细胞的emmprin的mrna和蛋白表达水平均明显降低(p0.05);a549nc组与空白对照a549组相比,emmprinmrna和蛋白表达水平无明显差异(p0.05)。2.emmprin可增强肺癌a549细胞增殖、迁移与侵袭的能力1)与空白对照a549组相比,a549emp组细胞增殖、迁移与侵袭能力明显增强(p0.05),而a549shemp组细胞增殖、迁移与侵袭能力能力明显降低(p0.05).2)上调emmprin的表达,可明显促进a549细胞β-catenin核表达,反之下调emmprin的表达,可明显抑制a549细胞β-catenin核表达;二、emmprin在肺癌介导的抑制成骨分化中作用机制的研究1.干扰emmprin表达可减弱肺癌a549细胞条件培养基(cm)介导的抑制成骨分化的能力:1)alp活性:与阳性对照组相比,a549shempcm组、a549nccm组及a549cm组mc3t3-e1细胞alp活性均明显减弱;而相比于a549cm组,a549shempcm组mc3t3-e1细胞alp活性明显增强,a549nccm组alp活性无明显差异。2)矿化:与阳性对照组相比,a549shempcm组、a549nccm组及a549cm组mc3t3-e1细胞钙化结节数量、面积明显减小;而相比于a549cm组,a549shempcm组mc3t3-e1细胞钙化结节数量、面积明显增大(p0.05),a549nccm组mc3t3-e1细胞钙化结节数量、面积无明显差异(p0.05)。3)成骨相关基因表达:与阳性对照组相比,a549shempcm组、a549nccm组及a549cm组mc3t3-e1细胞成骨分化相关标志基因col1α1、runx2/cbfa1和ocnmrna表达水平明显降低(p0.05);而相比于a549cm组,a549shempcm组mc3t3-e1细胞成骨分化相关标志基因col1α1、runx2/cbfa1和ocnmrna表达水平明显增高(p0.05),a549nccm组mc3t3-e1细胞成骨分化相关标志基因col1α1、runx2/cbfa1和ocnmrna表达水平无明显差异(p0.05)。2.emmprin可通过影响肺癌a549细胞dkk1的表达,影响成骨前体细胞β-catenin的活化,参与肺癌a549条细胞件培养基(cm)介导的成骨抑制作用1)dkk1的表达:干扰emmprin的表达可显著下调肺癌a549条细胞及肺癌a549条件培养基中dkk1的mrna和蛋白水平(p0.05),相反,过表达emmprin可显著上调肺癌a549条细胞及肺癌a549条件培养基中dkk1的mrna和蛋白水平(p0.05);2)mc3t3-e1细胞内β-catenin核表达:a549shempcm组、a549nccm组及a549cm组mc3t3-e1细胞内β-catenin核表达水平明显低于阳性对照组(p0.05),而相比于a549cm组,a549shempcm组mc3t3-e1细胞内β-catenin核表达水平明显增高(p0.05);a549empcm组mc3t3-e1细胞内β-catenin核表达水平与A549shEMPCM组刚好相反,即相比于A549CM组,A549EMPCM组成骨前体细胞内β-catenin核表达水平明显增高(P0.05);A549NCCM组与A549CM组相比,MC3T3-E1细胞内β-catenin核表达水平无明显差异(P0.05)。结论:一、EMMPRIN可增强肺癌A549细胞增殖、迁移及侵袭的能力,其机制可能与β-catenin的活化有关。二、EMMPRIN可通过下调肺癌A549细胞DKK1的表达,抑制成骨前体细胞β-catenin的活化,参与肺癌A549条细胞件培养基(CM)介导的成骨抑制作用。
【关键词】：肺癌 CD147 细胞外基质金属蛋白酶诱导因子 Wnt/β-catenin DKK1 骨转移
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 英文摘要6-10
• 中文摘要10-14
• 第一章 前言14-16
• 第二章 EMMPRIN对肺癌A549细胞增殖、迁移与侵袭能力的影响16-31
• 2.1 材料与方法16-26
• 2.2 结果26-29
• 2.3 讨论29-31
• 第三章 EMMPRIN通过下调DKK1的表达参与肺癌介导的抑制成骨分化31-45
• 3.1 材料与方法32-38
• 3.2 结果38-43
• 3.3 讨论43-45
• 全文结论45-46
• 参考文献46-51
• 文献综述CD147与肿瘤及骨转移的研究进展51-60
• 参考文献55-60
• 攻读学位期间发表的文章60-61
• 致谢61

【共引文献】

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本文编号：889158