子宫颈癌细胞中Src对ERK信号通路的调节作用

发布时间：2017-09-20 21:42

  本文关键词：子宫颈癌细胞中Src对ERK信号通路的调节作用

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【摘要】：目的:子宫颈癌的发生发展与信号通路中相关因子的异常表达有关。Src作为重要的信号因子,在多种组织类型的人类实体瘤中被激活和(或)蛋白表达过量。有研究表明,p-Src在子宫颈癌组织及细胞系中过度表达,并影响着疾病的进展和预后。ERK信号通路广泛参与调控肿瘤细胞的多种生物学功能,但在子宫颈癌细胞中Src对ERK信号通路的调节作用尚不清楚。本次研究采用体外细胞实验的方法,以ERK信号通路关键因子Src、ERK 1/2、c-Fos、c-Jun以及核转录调控因子hn RNP E1作为靶点,施加Src抑制剂干预,检测Src对其表达的影响及其与子宫颈癌细胞的关系,以此综合评价Src对子宫颈癌细胞中ERK信号通路的调节作用,为深入了解和认识子宫颈病变过程并寻找可能的干预途径提供理论依据。方法:选取子宫颈癌Hela细胞(HPV+)和C33A细胞(HPV-)进行实验研究。采用PP2对两种细胞的Src激酶施加干预,确定PP2的最佳抑制浓度(IC50)和抑制时点。设立Src抑制前组为对照组,Src抑制后组为实验组。采用活细胞计数法和CCK-8法测定抑制前后两种细胞的生长情况和细胞活性,行流式细胞术检测各组细胞的周期和及凋亡情况,分别采用Real-time PCR和Western-blot法检测Src、ERK 1/2、c-Fos、c-Jun、hn RNP E1的m RNA及蛋白表达水平。数据的录入和分析由SPSS 17.0软件执行。结果:1.PP2抑制效果的评价:(1)最佳抑制条件:传代后24h,20μM的PP2作用于Hela细胞,传代后24h,12μM的PP2作用于C33A细胞。(2)PP2抑制效果的评价:PP2明显下调了两种子宫颈癌细胞的p-Src蛋白水平,说明采用以上抑制条件,很好地达到了抑制效果。其中,Hela细胞的p-Src蛋白较抑制前下降了28.87%(t=4.547,P=0.045),C33A细胞的p-Src蛋白较抑制前下降了33.33%(t=5.354,P=0.033)。同时,Hela细胞的Src蛋白降低了33.56%(t=1.662,P=0.238),C33A细胞的Src蛋白降低了29.47%(t=3.233,P=0.082)。经比较,p-Src蛋白和Src蛋白抑制前后的降低值在C33A和Hela间无统计学差异(t=-0.139,P=0.893;t=-1.869,P=0.099)。(3)Src抑制后,两种子宫颈癌细胞的Src m RNA含量较抑制前升高(t=-1.137,P=0.306;t=-18.403,P=0.003),且Hela细胞的Src m RNA升高值显著大于C33A细胞(t=13.909,P0.001)。2.Src对子宫颈癌细胞一般生物学特性的影响:(1)Src影响细胞活性。Src抑制前,C33A细胞和Hela细胞迅速繁殖,C33A的生长速度慢于Hela。Src抑制后,两种细胞生长速度变慢,活细胞数大量减少(P0.001),最佳抑制条件下,各时点的PP2对C33A细胞和Hela细胞的抑制程度相似(P0.05)。(2)Src影响周期的转变。Src抑制后,C33A细胞和Hela细胞G0/G1期的比例分别升高了24.04%(t=6.101,P=0.004)和30.90%(t=-15.155,P0.001);S期的比例分别降低了24.46%(t=-5.842,P=0.013)和17.35%(t=13.384,P=0.001);C33A的G2/M降低了13.20%(t=-1.317,P=0.258),Hela的G2/M降低了32.75%(t=6.103,P=0.001)。仅见Hela的G2/M期对于PP2的反应程度大于C33A(t=4.614,P=0.002)。(3)Src具有促增殖抑凋亡的作用。Src抑制后,C33A的增殖指数(PI)降低了22.64%(t=-6.101,P=0.004),Hela的PI降低了20.89%(t=14.941,P0.001)。Src抑制前后,C33A的凋亡指数(AI)(6.90±1.50)%和(43.04±0.33)%均大于Hela的(3.74±1.11)%和(14.50±1.86)%。经比较,Src抑制前后,PI的降低值在Hela和C33A间无统计学差异(t=1.613,P=0.145),而Hela细胞的AI的升高值远低于C33A细胞(t=25.834,P0.001)。3.子宫颈癌细胞中Src对ERK 1/2、c-Jun、c-Fos、hn RNP E1基因表达的影响:(1)Src抑制后,Hela和C33A的ERK 1、ERK 2、c-Fos、c-Jun的m RNA含量较抑制前显著升高(P0.05),hn RNP E1 m RNA含量较抑制前显著降低(P0.05)。经比较,抑制前后ERK 1、c-Fos、c-Jun的m RNA在Hela中的升高值均显著大于C33A(P0.05)。(2)Src抑制后,Hela和C33A中的p-Src蛋白、ERK 1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白、p-c-Fos蛋白和hn RNP E1蛋白含量较抑制前显著降低(P0.05),c-Jun蛋白和p-c-Jun蛋白含量较抑制前显著升高。经比较,抑制前后p-Src蛋白、p-ERK 1/2蛋白和c-Fos蛋白含量在C33A的降低值大于Hela,而其c-Jun和p-c-Jun蛋白含量的升高值却低于Hela,p-c-Fos蛋白和hn RNP E1蛋白含量的降低值在C33A和Hela间无统计学差异(P0.05)。结论:1.PP2作用于Src激酶的磷酸化,即可明显下调两种子宫颈癌细胞的p-Src蛋白含量。Src抑制后,两种子宫颈癌细胞的Src m RNA相对含量升高,提示在基因的转录水平可能存在维稳机制或其他信号因子参与调控Src基因的表达。结合Src抑制前后,Src m RNA在HPV阳性的Hela细胞中的升高值大于HPV阴性的C33A细胞,而Hela的p-Src蛋白含量的降低值小于C33A的结果,提示Src可能受HPV诱导而激活。2.Src可促进子宫颈癌细胞的恶性转变。Src干预后,C33A和Hela的细胞活性降低,G0/G1期所占比例升高,S和G2/M比例下降,PI降低,AI上升,提示子宫颈癌细胞的恶性转变与Src激酶的活性呈正相关,Src活化可加速G0/G1向S期的转变,为肿瘤细胞的恶性增殖提供先决条件,提示Src可作为子宫颈癌治疗的潜在靶点。3.Src可影响ERK信号通路关键因子及核转录调控因子的表达。Src抑制后,C33A细胞和Hela细胞的ERK 1、ERK 2、c-Jun和c-Fos基因的m RNA含量升高,hn RNP E1m RNA含量降低,p-Src蛋白、ERK 1/2蛋白、p-ERK 1/2蛋白、p-c-Fos蛋白和hn RNP E1蛋白含量降低。提示Src参与调控ERK信号通路一系列关键因子以及核转录调控因子的表达(效应蛋白水平作用更显著),促进子宫颈癌变的进展。相关信号因子的m RNA水平在Src抑制后出现上调可能与磷酸化的效应蛋白含量降低后触发了多环节的负反馈调控作用有关。Src抑制后,c-Jun基因区别于c-Fos基因的变化趋势,出现了m RNA和蛋白水平的双提升,揭示了ERK信号通路的复杂性。4.经比较,Src抑制前后,HPV阴性的C33A细胞的PI降低值与HPV阳性的Hela细胞水平相当,而C33A的AI的升高值远大于Hela,且C33A细胞的p-Src蛋白、p-ERK 1/2蛋白、c-Fos蛋白含量的降低值也显著大于Hela细胞,进一步提示,Src活化与HPV感染可协同调控ERK信号通路中一系列关键因子的表达,促进子宫颈癌变的进展。要想证实HPV感染确实在这一过程中发挥作用,需要在同种细胞中,在施加Src抑制剂干预的同时,开展针对HPV E6/E7等癌蛋白的表达或抑制。
【关键词】：子宫颈癌细胞 Src ERK信号通路 hnRNPE 1 调节作用
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.33
【目录】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 常用缩写词中英文对照表12-13
• 前言13-15
• 1 材料与方法15-28
• 1.1 材料15-18
• 1.2 实验方法18-27
• 1.3 资料整理与分析27
• 1.4 质量控制27-28
• 2 结果28-42
• 2.1 Src抑制体系的建立28-30
• 2.2 Src对子宫颈癌细胞一般生物学特性的影响30-35
• 2.3 Src对ERK信号通路关键因子表达的影响35-42
• 3 讨论42-47
• 3.1 Src对子宫颈癌细胞生物学特性的影响42-43
• 3.2 Src可激活子宫颈癌细胞中的ERK信号转导通路43-44
• 3.3 Src对核转录因子c-Fos基因和c-Jun基因表达的影响44
• 3.4 Src对核转录调控因子hnRNP E1 基因表达的影响44-45
• 3.5 HPV感染与Src激活可能具有协同作用45-47
• 4 结论47-48
• 参考文献48-53
• 综述53-62
• 参考文献57-62
• 致谢62-63
• 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果63-64
• 个人简历64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

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2 胡德庆;杨晓明;;PCBP1:一种在多水平上参与基因表达调控的蛋白因子[J];军事医学科学院院刊;2007年03期

3 陈加祥;徐林林;吴圣娇;刘红宇;王晶磊;邹挺;;c-SRC基因敲减降低宫颈癌HeLa细胞活性及磷酸化的信号转导与转录激活子-3蛋白表达[J];生理学报;2011年03期

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1 高晨菲;ERK对c-Fos、c-Jun在宫颈癌细胞中表达的调节作用[D];山西医科大学;2014年

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本文编号：890587