SPC24基因在原发性肝细胞癌中的表达及功能的初步研究

发布时间：2017-09-21 11:45

  本文关键词：SPC24基因在原发性肝细胞癌中的表达及功能的初步研究

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【摘要】：目的:作为核分裂周期80(nuclear division cycle 80,Ndc80)动点蛋白复合物的核心组分之一,SPC24基因参与并调控细胞有丝分裂的重大分子事件,例如:动点-微管的精准耦合、染色体的正确列队、染色体的均等分裂等。然而,SPC24基因与原发性肝细胞癌(肝癌)(Hepatocellular carcinoma,HCC)发生、发展、浸润、转移之间的关联性仍然未知。本文旨在研究SPC24基因在肝癌组织中的表达水平,并且深入地分析SPC24基因的表达与肝癌患者临床病理参数之间的关系,为寻找新的肝癌诊断指标以及潜在的治疗靶点提供可靠的实验依据。方法:1.本研究选取2001年11月至2007年4月期间于桂林医学院附属医院行根治性手术切除的肝癌患者。选取了212例肝癌患者的癌组织及其相应的癌旁肝组织样本(adjacent normal liver tissues,ANLT),9例正常肝组织(选自肝血管瘤患者)样本。2.首先选用普通RT-PCR方法检测20对肝癌组织和相应癌旁组织,以及9例正常肝组织样本中SPC24 mRNA的表达情况;进一步采用Real-time PCR分析212对肝癌及相应癌旁组织样本中SPC24 m RNA的表达水平。3.应用免疫组织化学(Immunohistoehemistry,IHC)方法检测69对肝癌组织和相应癌旁组织,以及9例正常肝组织样本中SPC24蛋白的表达模式;并且采用Western-blot实验分析40对肝癌组织和相应癌旁组织,以及9例正常肝组织样本中SPC24蛋白的表达水平。4.rt-pcr方法检测12种人肝癌细胞系(hep3b,sk-hep1,huh7,smmc7721,mhcc97l,mhcc97h,plc,hepg2,qgy7703,bel7402,bel7404,bel7405)和1种正常肝细胞系(lo2)中spc24mrna的表达水平,筛选出适用于细胞生物学实验的肝癌细胞系。5.应用whitehead公司的在线设计软件(http://jura.wi.mit.edu/bioc/sirnaext/)设计3对特异性靶向spc24基因的小干扰rna(smallinterferingrna,sirna)序列及1对阴性对照序列,并由上海吉玛制药技术有限公司合成。将对数生长期的人肝癌细胞系smmc7721和hepg2细胞接种于6孔板,待细胞融合率达到60-80%时,将针对spc24基因的特异性sirna转染至smmc7721和hepg2肝癌细胞,分别提取转染后48h、72h的细胞总rna及蛋白。并采用rt-pcr及western-blot实验技术检测转染效果。6.采用沉默肝癌细胞内源性spc24效果最佳的sirna-2进行后序的细胞生物学实验。spc24sirna-2转染至smmc7721和hepg2肝癌细胞后,采用细胞计数cck-8试剂盒(cellcountingkit-8,cck-8)分析肝癌细胞增殖及粘附比例的变化。7.spc24sirna-2转染至smmc7721和hepg2肝癌细胞后,采用transwell侵袭实验分析肝癌细胞侵袭能力的变化。8.spc24sirna-2转染至smmc7721和hepg2肝癌细胞后,选取western-blot实验检测肝癌细胞中cleavedcaspase-3表达量的变化,分析肝癌细胞凋亡能力的变化。结果:1.rt-pcr检测的20对样本中,与相应癌旁组织比较,有18例(90%)肝癌样本中动点相关基因spc24mrna表达显著上调,而在9例正常肝组织中spc24mrna表达量十分微弱。realtimepcr检测的212对样本中,有155例(73.1%)肝癌样本中spc24mrna表达显著上调,而仅有57例(26.9%)spc24mrna表达量呈下调状态。肝癌组织中spc24mrna表达显著高于对应癌旁组织(mean±sd,1.123±0.072和0.350±0.036,p0.0001)。2.ihc检测69对hcc样本中spc24蛋白水平情况,结果显示:有51例(73.90%)肝癌患者组织中的spc24蛋白水平明显高于相应的癌旁组织,而仅有22例(31.90%)癌旁肝组织中spc24蛋白呈现高表达水平,同时,在9例正常肝组织中,spc24蛋白水平呈阴性。western-blot检测的40对样本中spc24蛋白质的表达情况,结果表明:有35例(87.50%)肝癌患者组织中的spc24蛋白水平明显高于相对应的癌旁组织,而在9例正常肝组织中,spc24蛋白水平极低,或检测不到。3.rt-pcr检测结果显示:spc24mrna在人肝癌细胞系hep3b,huh7,smmc7721,mhcc97h,plc,hepg2,qgy7703,bel7404,bel7405中表达明显上调,而在lo2,mhcc97l,sk-hep1,bel7402等细胞系中则表达相对较弱。4.rt-pcr和westernblotting检测结果显示:用针对spc24基因的特异性sirnas干扰人肝癌细胞系smmc7721和hepg2后,肝癌细胞中内源性spc24mrna和蛋白质表达水平明显降低。并且,spc24sirna-2的靶向沉默效果最佳,所以我们选用spc24sirna-2进行后序的细胞生物学实验。5.与sirna阴性对照组比较,spc24sirna-2显著抑制人肝癌细胞系smmc7721和hepg2细胞的生长能力、粘附能力、和侵袭能力。westernblot检测发现转染spc24sirna-2的肝癌细胞中cleavedcaspase-3表达量明显上调,表明沉默肝癌细胞内源性spc24基因后可引发细胞凋亡事件。6.相关性分析结果显示:肝癌组织中spc24mrna的高表达水平与血清甲胎蛋白水平(alpha-fetoprotein,AFP)(200 ng/ml)、较大的肿瘤、多发肿瘤、以及巴塞罗那临床肝癌分期(barcelona clinic liver cancer staging classification,BCLC)为B-C期等因素呈正相关(p0.05)。7.采用Kaplan-Meier曲线评估,我们发现,与低表达SPC24的患者比较,高表达SPC24的患者术后无瘤生存时间(disease-free survival,DFS)(p0.001)和总生存时间(overall survival,OS)(p=0.001)更短。多因素分析显示,SPC24表达上调可作为预测肝癌预后的独立因素。结论:SPC24在肝癌组织中表达明显上调,有可能作为预测肝癌病人预后的新生标志物。此外,siRNA沉默SPC24基因后可显著抑制肝癌细胞增殖能力,表明SPC24基因可作为治疗肝癌的靶向目标。
【关键词】：原发性肝细胞癌 SPC24 增殖 侵袭 预后
【学位授予单位】：桂林医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 中文摘要5-9
• ABSTRACT9-14
• 英汉缩略词对照表14-16
• 前言16-18
• 1 材料与方法18-39
• 1.1 主要实验材料18-19
• 1.2 主要实验试剂19-22
• 1.3 主要实验仪器22-23
• 1.4 实验方法23-39
• 2 结果39-54
• 2.1 SPC24 m RNA在肝癌组织中表达上调39-40
• 2.2 SPC24与肝癌患者血清AFP水平呈正相关40-41
• 2.3 SPC24蛋白在肝癌组织中表达上调41-42
• 2.4 SPC24的表达水平与肝癌患者的临床病理参数呈正相关42-44
• 2.5 SPC24高表达、临床病理参数与肝癌患者术后无瘤生存时间、总生存时间之间的关系44-47
• 2.6 SPC24高表达与肝癌患者术后生存时间的关系47-48
• 2.7 SPC24表达水平可作为肝癌亚组患者的预后因子48-50
• 2.8 RNA干扰内源性SPC24基因明显抑制肝癌细胞的生长、粘附以及侵袭能力50
• 2.9 RNA沉默内源性SPC24基因可诱导肝癌细胞的凋亡50-54
• 3 讨论54-56
• 4 结论56-57
• 参考文献57-64
• 综述64-74
• 参考文献68-74
• 攻读学位期间发表的学术论文目录74
• 攻读学位期间参与的科研课题74-75
• 致谢75-76

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本文编号：894359