抗PSMA适配子介导的细胞自噬与促凋亡系统的构建及其抗前列腺癌功能的初步研究

发布时间：2017-09-22 11:43

  本文关键词：抗PSMA适配子介导的细胞自噬与促凋亡系统的构建及其抗前列腺癌功能的初步研究

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【摘要】：目的:构建自噬相关基因Beclin1的进化保守区ECD(evolutionary conserved district,ECD)和链霉亲和素(streptavidin,SA)重组质粒,表达纯化SA-ECD融合蛋白;建立抗PSMA适配子介导的自噬分子ECD和促凋亡开关分子NuBCP-9-r8靶向系统并初步研究其对前列腺癌细胞的功能。方法:首先采用基因合成技术获取靶基因SA-ECD,为了给下一步蛋白表达做准备,对目的序列进行密码子优化,并且在其前面添加了起始密码子ATG和一个His标签,共1011bp;然后克隆至pUC57载体鉴定无误后,再将其定向插入原核表达载体pET30a,以NdeI和HindⅢ作为酶切位点进行引物设计用于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)及双酶切鉴定筛选阳性克隆,随后进行序列测定。测序分析正确后,将pET30a-SA-ECD转化至BL21作为表达菌株,以IPTG终浓度1mmol/l,15℃诱导16h,37℃诱导4h作为表达的摸索条件。获得的sa-ecd融合蛋白由镍亲和凝胶层析柱及westernblotting分别进行纯化与鉴定。细胞穿膜实验鉴定八聚精氨酸(r8)的穿膜效率;利用链霉亲和素-生物素间高效特异结合的特性将融合蛋白sa-ecd、生物素标记的抗psma适配子及nubcp-9-r8按一定比例偶联起来,构建抗psma适配子靶向的细胞自噬和促凋亡系统,并采用emsa检测sa-ecd与生物素标记的抗psma适配子及nubcp-9-r8间的结合力;采用cck-8(cellcountingkit-8)、流式细胞术(flowcytometry,fcm)、台盼蓝染色、细胞形态学分析、吖啶橙染色、westernblotting等方法初步验证其对前列腺癌细胞的自噬与凋亡的诱导作用。结果:双酶切及基因测序证实重组质粒pet30a-sa-ecd构建成功;sa-ecd融合蛋白(含his标签)经iptg诱导在大肠杆菌中得以表达,低温且延长时间更利于蛋白的表达,所以选择iptg终浓度1mmol/l,15℃诱导16h作为表达的优化条件进行大量诱导表达;但融合蛋白sa-ecd主要存在于包涵体中,可溶性不足10%;为此,我们放大表达系统,对培养上清中的sa-ecd蛋白进行镍亲和凝胶层析柱纯化及westernblotting鉴定,验证其大小约为38kd,与理论相一致。荧光显微镜下观察到,与fitc-nubcp-9相比,fitc-nubcp-9-r8的荧光强度明显增强,说明八聚精氨酸(r8)能高效的穿过细胞膜;emsa实验结果可见,与biotin-a10/nubcp-9-r8组相比,sa-ecd+biotin-a10/nubcp-9-r8组呈现明显滞后的条带,而bsa+biotin-a10/nubcp-9-r8组则没有明显变化,证明融合蛋白sa-ecd能有效结合生物素标记的抗psma适配子及nubcp-9-r8;成功构建抗psma适配子靶向的细胞自噬和促凋亡系统,cck-8法检测lncap细胞存活率,结果显示靶向系统组对细胞的杀伤效果与sa-ecd组及a10-nubcp-9-r8组相比差异具有显著性(p0.01);流式细胞术显示浓度0-40μg/ml的靶向系统组引起lncap细胞总凋亡百分率分别为(4.6±1.53)%、(6.98±2.12)%、(16.60±2.48)%、(42.03±2.28)%及(70.66±1.95)%,除5μg/ml组外,与阴性对照组的细胞凋亡率相比,差异均有统计学意义(p0.01);台盼蓝染色中与对照组相比,sa-ecd组中lncap、c4-2、pc-3及hela的细胞活力下降(p0.05),a10-nubcp-9-r8组中上述四种细胞的细胞活力没有明显变化(p0.05),而靶向系统组中lncap和c4-2的细胞活力显著降低(P0.01),说明靶向系统对PSMA(+)前列腺癌细胞有显著的杀伤作用;形态学分析结果进一步从形态学方面证实上述结论;吖啶橙和Western blotting检测显示靶向系统在一定浓度范围内,既能诱导LNCaP细胞自噬又能促进其凋亡。结论:本研究成功构建pET30a-SA-ECD重组质粒并表达纯化出融合蛋白SA-ECD;构建的抗PSMA适配子靶向的细胞自噬和促凋亡系统显示其对PSMA(+)前列腺癌细胞有杀伤作用,为探索治疗前列腺癌的新途径奠定了基础。
【关键词】：前列腺癌 进化保守区 融合蛋白 链霉亲和素 前列腺特异性膜抗原 适配子 NuBCP-9-r8 自噬 凋亡
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.25
【目录】：

• 缩略语表6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-14
• 前言14-15
• 文献回顾15-26
• 第一部分 重组表达质粒pET 30a-SA-ECD的构建26-41
• 引言26
• 1 材料26-28
• 1.1 载体26-27
• 1.2 菌种27
• 1.3 主要试剂及缓冲液27
• 1.4 常用培养基、琼脂糖凝胶及其配制方法27-28
• 1.5 主要仪器28
• 2 方法28-34
• 2.1 目的基因的设计28-32
• 2.2 载体的准备32-33
• 2.3 载体与目的基因连接33
• 2.4 重组质粒鉴定33-34
• 3 结果34-39
• 3.1 目的基因鉴定34-36
• 3.2 重组表达质粒的鉴定结果36-39
• 4 讨论39-41
• 第二部分 融合蛋白SA-ECD的表达与纯化41-51
• 引言41
• 1 材料41-42
• 1.1 菌种41
• 1.2 主要试剂、缓冲液41-42
• 1.3 常用试剂、缓冲液及培养基的配制方法42
• 1.4 主要仪器42
• 2 方法42-46
• 2.1 融合蛋白的诱导表达及Western-blot初步鉴定42-44
• 2.2 融合蛋白的大量诱导表达及其纯化、鉴定44-45
• 2.3 Bradford法测定蛋白浓度45-46
• 3 结果46-49
• 3.1 成功表达并初步鉴定融合蛋白SA-ECD46-47
• 3.2 成功纯化并鉴定融合蛋白SA-ECD47-48
• 3.3 蛋白浓度测定48-49
• 4 讨论49-51
• 第三部分 靶向系统的构建及其抗前列腺癌功能的初步研究51-66
• 引言51
• 1 材料51-52
• 1.1 细胞51
• 1.2 主要试剂51-52
• 1.3 主要仪器52
• 2 方法52-56
• 2.1 靶向系统的构建52-53
• 2.2 电泳迁移率试验（EMSA）53-54
• 2.3 CCK-8 法检测细胞存活率54
• 2.4 细胞凋亡检测54
• 2.5 台盼兰染色法鉴定细胞活力54-55
• 2.6 形态学观察55
• 2.7 细胞自噬形态学观察55
• 2.8 Western blot检测相关蛋白表达55-56
• 2.9 统计学方法56
• 3 结果56-64
• 3.1 八聚精氨酸（R_8）能高效的穿过细胞膜56-57
• 3.2 SA-ECD可特异性结合A10-biotin及biotin-NuBCP9R_857-58
• 3.3 靶向系统降低前列腺癌LNCaP细胞存活率58
• 3.4 靶向系统促进前列腺癌LNCaP细胞凋亡58-60
• 3.5 靶向系统降低PSMA(+)前列腺癌细胞活力60
• 3.6 靶向系统破坏PSMA(+)前列腺癌细胞形态60-61
• 3.7 靶向系统诱导前列腺癌LNCaP细胞发生自噬61-62
• 3.8 靶向系统影响LNCaP细胞自噬及凋亡相关蛋白表达62-64
• 4 讨论64-66
• 小结66-67
• 参考文献67-77
• 个人简历和研究成果77-78
• 致谢78

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本文编号：900659