TNF-α促进Th9细胞生成的作用和机制研究

发布时间：2017-09-23 09:24

  本文关键词：TNF-α促进Th9细胞生成的作用和机制研究

  更多相关文章： Th9 IL-9 TNF-α TNFR2 STAT5 NF-κB

【摘要】：目的:免疫治疗是近年来最具前景的肿瘤治疗方法。在肿瘤免疫治疗中,细胞免疫起着至关重要的作用。抗肿瘤效应T细胞包括CD4~+辅助性T细胞和CD8~+细胞毒性T细胞。Th9细胞是新近发现的一种Th细胞亚型,其主要特征是可分泌大量的IL-9。我们和其他研究团队最近发现Th9/IL-9在小鼠体内具有很强的抗肿瘤活性,其对肿瘤的抑制效应要优于其他Th细胞。这表明,在肿瘤免疫治疗中如何更有效的诱导和扩增肿瘤特异性Th9细胞对提高肿瘤免疫疗效具有重要意义。OX40/OX40L曾被认为是唯一能促进Th9细胞生成的TNF/TNF受体家族成员。然而,最近的研究表明TNF/TNF受体家族成员TL1A和GITR也能强有力的促进Th9细胞的生成。这提示,TNF/TNF受体家族其他成员,如代表TNF家族原型的TNF-α,也可能有助于Th9细胞生成并促进Th9/IL-9发挥抗肿瘤效应。因此,本课题的研究目的是探讨TNF-α在促进Th9细胞生成中的作用,并阐明其作用机制,为肿瘤免疫治疗提供新策略。方法:为了研究TNF-α在Th9细胞生成中的作用,通过流式细胞分选仪分选得到初始CD4~+T细胞(CD4~+CD25~-CD62L~(hi)),在Th9细胞极化条件下(抗CD3/CD28抗体和TGFβ/IL-4),加入或不加入TNF-α,体外诱导Th9细胞生成。然后以q PCR、ELISA和/或流式细胞仪检测Th9细胞表达的IL-9 m RNA和蛋白水平,并检测Th9细胞的存活情况及细胞活性。TNF-α受体包括TNFR1和TNFR2,首先通过流式细胞仪检测初始CD4~+T细胞的TNFR1和TNFR2的表达情况。然后在Th9细胞极化条件下,加入TNFR1或TNFR2的封闭抗体,检测封闭TNFR1或TNFR2能否影响TNF-α对Th9细胞生成的促进作用。TNF/TNF受体家族成员OX40/OX40L、TL1A和GITR促进Th9细胞生成依赖于NF-κB或STAT5信号通路,为了研究TNF-α诱导Th9细胞生成过程中是否活化了NF-κB或STAT信号,在Th9细胞极化条件下,通过Western Blot检测STAT分子的磷酸化水平。加入STAT5抑制剂或NF-κB抑制剂,检测TNF-α能否促进Th9细胞的生成。然后通过荧光素酶报告系统进一步验证NF-κB分子是否能结合并活化Il9启动子。结果:TNF-α显著促进了Th9细胞的生成,促进了Th9细胞存活,并增强了Th9细胞的细胞活性。TNF-α诱导的Th9细胞除了Il5和Il13有少量增加外,不表达已知的Th9细胞相关转录因子Pu.1和Irf4,以及其他Th细胞的特异性转录因子和细胞因子。初始CD4~+T细胞表达TNFR1和TNFR2,封闭TNFR2显著抑制了TNF-α对Th9细胞生成的促进作用,封闭TNFR1则不会抑制TNF-α对Th9细胞生成的促进作用。TNF-α能活化STAT5,抑制STAT5减弱了TNF-α促进Th9细胞生成的作用。而抑制NF-κB也能抑制TNF-α促进Th9细胞生成的作用,且NF-κB分子能结合并活化Il9启动子,从而促进IL-9的表达。结论:TNF-α通过TNFR2/STAT5和TNFR2/NF-κB信号通路来促进Th9细胞的生成。
【关键词】：Th9 IL-9 TNF-α TNFR2 STAT5 NF-κB
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.51
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-13
• 第1章 绪论13-20
• 1.1 Th9细胞的发现13-14
• 1.2 Th9细胞的生成14-15
• 1.3 Th9细胞的调控15-16
• 1.4 Th9细胞与肿瘤免疫16-18
• 1.5 TNF-α 与Th细胞的关系18
• 1.6 本课题研究目的18-20
• 第2章 材料与方法20-30
• 2.1 材料20-23
• 2.1.1 实验动物20
• 2.1.2 主要试剂20-21
• 2.1.3 主要仪器21-22
• 2.1.4 主要试剂的配制22-23
• 2.2 方法23-30
• 2.2.1 分选初始CD4~+ T细胞（CD4~+ CD25~- CD62L~(hi)）23
• 2.2.2 体外诱导Th9细胞23-24
• 2.2.3 胞内染色24
• 2.2.4 RNA的提取24-25
• 2.2.5 cDNA的合成25
• 2.2.6 qPCR25-27
• 2.2.7 ELISA27
• 2.2.8 Western Blot27-28
• 2.2.9 荧光素酶报告基因系统28-29
• 2.2.10 统计学方法29-30
• 第3章 结果30-39
• 3.1 TNF-α 促进Th9细胞的生成30-32
• 3.1.1 TNF-α 促进Th9细胞生成30-31
• 3.1.2 TNF-α 诱导的Th9细胞不表达其他Th细胞的转录因子和细胞因子31-32
• 3.2 TNF-α 促进Th9细胞存活32-33
• 3.3 TNF-α 促进Th9细胞表达CD4433-34
• 3.4 TNF-α 通过TNFR2促进Th9细胞生成34-35
• 3.4.1 初始CD4~+ T细胞表达TNFR1和TNFR234
• 3.4.2 封闭TNFR2抑制TNF-α 对Th9细胞生成的促进作用34-35
• 3.5 TNF-α 通过激活STAT5信号通路促进Th9细胞的生成35-37
• 3.5.1 TNF-α 活化STAT535-36
• 3.5.2 抑制STAT5减弱TNF-α 对Th9细胞生成的促进作用36-37
• 3.6 TNF-α 通过激活NF-κB信号通路促进Th9细胞的生成37-39
• 3.6.1 抑制NF-κB减弱TNF-α 对Th9细胞生成的促进作用37
• 3.6.2 荧光素酶报告系统检测NF-κB分子与Il9启动子的结合情况37-39
• 第4章 讨论39-42
• 第5章 结论42-43
• 参考文献43-48
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果48-49
• 致谢49

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