宫颈癌相关生物标记物检测新方法研究

发布时间：2017-09-24 23:22

  本文关键词：宫颈癌相关生物标记物检测新方法研究

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【摘要】：在世界范围内,宫颈癌是女性易发癌症之一,在欠发达地区宫颈癌的发病率远远高于发达区域。分子生物学和流行病学研究证实,人类乳头瘤病毒对于上皮细胞的持续感染可以导致子宫颈罹癌或病变。目前,研究人员以发现超过100多种人乳头状瘤病毒类型,这其中,HPV16型普遍在肛门和其它生殖器官的癌变组织中,HPV16连同HPV18、HPV31、HPV33、 HPV35和其它几种易存在与肛门-生殖器癌变组织的型别,被称为“高风险”型。相比之下,主要存在于疣和其它病变组织中的人类乳头瘤病毒类型被指定为“低风险”类型。高危型HPV的持续感染,导致包括E6、E7基因在内的关键癌蛋白编码基因的过量表达,E6、E7的过表达必将编码癌蛋白与重要的细胞周期调控分子或肿瘤抑制基因p53相互作用,降解或抑制其活性,导致恶性转变。尽管HPV是DNA病毒,由于较低的临床特异性和较弱实际价值,人乳头状瘤病毒DNA检测没有被广泛接受为主要筛查手段。在本工作中,NASBA、两步法RT-PCR和一步法RT-PCR联合芯片电泳用于成HPV16E6/E7mRNA的检测；本工作的另一部分是选择p53蛋白作为宫颈癌生物标志物,基于滚环扩增和氯高铁血红素/G-四联体技术对其进行分析检测。本研究的主要内容和结论如下：第一章综述了子宫颈癌和人乳头瘤病毒之间的关系,简要介绍和比较了细胞学检测、HPV DNA检测和E6/E7mRNA检测。第二章针对三种不同的核酸扩增技术联合芯片电泳对HPV 16 E6/ E7 mRNA检测做了比较型的研究。这些研究具有高通量、高可靠性的特点,相对于传统耗时的毛细管电泳或分子信标检测方法,检测耗时大大缩短。基于核酸序列扩增技术(NASBA)、一步法RT-PCR和两步法RT-PCR的HPV筛查检测技术已经建立。相信在进一步修改和完善后,这种方法能够在肛门-生殖器癌临床诊断和预后中发挥作用。第三章p53作为一种肿瘤抑制蛋白、转录因子,在细胞生长控制、DNA修复、细胞程序性调亡过程中起着重要的作用。p53被证实与宫颈癌相关,p53蛋白和E6蛋白的结合在宫颈癌的发生核发展过程中起着重要作用。在这项工作中,我们计划设计制造一个简易、便携的芯片装置,以期实现p53蛋白的高敏感性和高选择性检测。p53蛋白在微通道中被选择性捕获,然后是借助RCA实现目标放大,再借助RCA扩增得到的G-quadruplex结构单元,催化ABTS-hemin-H2O2体系发光体系,实现信号放大,最后进行比色测定。
【关键词】：宫颈癌 人乳头瘤病毒 E6/E7信使RNA 芯片毛细管电泳 p53蛋白 滚环扩增技术
【学位授予单位】：北京化工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.33
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-13
• 第一章 绪论13-29
• 1.1 宫颈癌和人乳头瘤病毒13-20
• 1.1.1 E6和E7蛋白与宫颈癌的发生15-16
• 1.1.2 HPV的检测16-20
• 1.1.2.1 细胞学检测16-17
• 1.1.2.2 HPV DNA检测17-19
• 1.1.2.3 HPV mRNA的检测19-20
• 1.2 依赖核酸序列扩增技术20-22
• 1.2.1 NASBA概述20
• 1.2.2 NASBA的基本原理20-21
• 1.2.3 NASBA的应用21-22
• 1.3 p53和癌症22-25
• 1.4 滚环扩增技术25-27
• 1.4.1 RCA概述26
• 1.4.2 RCA的基本原理26
• 1.4.3 RCA的应用26-27
• 1.5 本论文的立题内容和意义27-29
• 第二章 比较三种不同的核酸扩增技术联合芯片毛细管电泳用于HPV16E6/E7 mRNA的检测29-50
• 2.1 前言29
• 2.2 实验部分29-36
• 2.2.1 宫颈癌细胞的选择和培养29-30
• 2.2.2 宫颈癌细胞总RNA提取30-31
• 2.2.3 依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)扩增HPV16 E6/E7 mRNA31-33
• 2.2.4 RNA反转录实验33
• 2.2.5 RT-PCR用于HPV16型E6XE7相关mRNA反转录和扩增33-35
• 2.2.6 实验所需试剂及仪器35-36
• 2.3 结果与讨论36-49
• 2.3.1 芯片毛细管电泳(MCE)分离缓冲液的配制37-39
• 2.3.2 总RNA提取质量分析39-40
• 2.3.3 依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)条件优化40-42
• 2.3.4 依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)联合芯片毛细管电泳(MCE)检测E6/E7 mRNA特异性和灵敏度42-44
• 2.3.5 两步法RT-PCR联合芯片毛细管电泳(MCE)检测E6/E7 mRNA44-46
• 2.3.6 一步法RT-PCR联合芯片毛细管电泳(MCE)检测E6/E7 mRNA46-47
• 2.3.7 RT-PCR联合芯片毛细管电泳(MCE)检测HPV18型E6/E7 mRNA47-49
• 2.4 本章小结49-50
• 第三章 基于滚换扩增技术和血晶素/G-四联体体系双官能团比色检测P53蛋白50-59
• 3.1 前言50-51
• 3.2 实验部分51-54
• 3.2.1 芯片制备和修饰51-53
• 3.2.2 probe-primer-circle-template制备53
• 3.2.3 滚环扩增(RCA)和p53蛋白检测53-54
• 3.3 结果与讨论54-58
• 3.3.1 probe-primer-circle-template制备54
• 3.3.2 滚环扩增(RCA)和P53蛋白检测54-58
• 3.4 本章小结58-59
• 第四章 结论59-60
• 参考文献60-68
• 附录68-69
• 致谢69-70
• 研究成果及发表的学术论文70-71
• 作者与导师简介71-72
• 附件72-73

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1 刘全利;宫颈癌相关生物标记物检测新方法研究[D];北京化工大学;2015年

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本文编号：914045