ATRX-C抗体的制备及在HPV16阳性宫颈癌组织中的初步应用

发布时间：2017-09-25 20:03

  本文关键词：ATRX-C抗体的制备及在HPV16阳性宫颈癌组织中的初步应用

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【摘要】：[目的]研制和初步评价ATRX-C抗体;分析ATRX蛋白在THP-1细胞中的定位及ATRX在人乳头瘤病毒16型(HPV16)阳性宫颈癌组织中的表达和定位,为深入探讨ATRX蛋白在HPV16所致宫颈癌中的作用及机制奠定基础。[方法]设计ATRX C端基因片段(2193-2492氨基酸)引物,利用PCR扩增目的片段,双酶切后连接表达载体p ET30a,经PCR、酶切、测序分析,构建原核表达载体p ET30a/ATRX-C2193-2492;将质粒p ET30a/ATRX-C2193-2492转化E.coli BL21,IPTG诱导表达,利用镍离子亲和层析法纯化6His-ATRX-C2193-2492蛋白,利用Western blot检测纯化产物6His-ATRX-C2193-2492;将纯化后的6His-ATRX-C2193-2492蛋白以皮下多点注射和腹腔注射方式免疫接种6只8周龄雌性BALB/c小鼠。初次免疫3周后,再免疫1次;第4、5周后分别再加强1次,共免疫接种4次。每次免疫前及末次免疫后7天取血,ELISA测定抗体效价。饱和硫酸铵盐析沉淀法初步纯化抗血清,并用Western blot检测之;利用间接免疫荧光检测Daxx和ATRX在THP-1细胞株中的分布与定位;收集正常宫颈组织细胞、HPV16阳性的宫颈上皮内瘤变(CIN)、原位癌和浸润型宫颈癌组织标本,通过免疫组化技术检测宫颈组织中ATRX的分布和定位以及表达量;利用Western blot检测正常宫颈组织,HPV16阳性的宫颈上皮内瘤变(CIN)、原位癌和浸润型宫颈癌组织细胞中ATRX的表达量。[结果]经PCR、双酶切和测序鉴定,成功构建p ET30a/ATRX-C2193-2492原核表达载体;表达载体p ET30a/ATRX-C2193-2492在E.coli中诱导表达分子量约34k Da产物,且该产物能与ATRX抗体发生反应,并且纯化得到目的产物;利用纯化后的6His-ATRX-C2193-2492蛋白免疫小鼠,制备的抗ATRX-C2193-2492多克隆抗体,其效价为1:12800;在THP-1细胞中,ATRX显绿色信号和Daxx显红色信号,两种信号都定位于细胞核,融合时出现黄色信号;ATRX在正常宫颈组织细胞具有较高表达并主要定位在细胞核;在HPV16阳性的宫颈上皮内瘤变(CIN)组织细胞的表达与正常细胞类似;在原位癌组织细胞中表达量姣CIN中减低,主要定位在细胞核和细胞浆;在浸润型宫颈癌组织细胞中表达量降低,主要定位在细胞浆,细胞核中表达量明显减少。[结论]制备的ATRX-C2193-2492抗血清可用于检测组织和细胞中的ATRX蛋白;ATRX蛋白在THP-1细胞核和正常宫颈组织细胞中大量表达;在HPV16阳性所致的宫颈癌进程中,其表达量可能逐渐减少。
【关键词】：ATRX 抗体 人乳头瘤病毒16型(HPV16) 宫颈癌 定位
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.33
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 主要英文缩略语索引9-13
• 第1章 绪论13-15
• 第2章 材料与试剂15-19
• 2.1 主要实验仪器15-16
• 2.2 菌种、质粒和细胞株16
• 2.3 主要实验试剂16-19
• 第3章 实验方法19-31
• 3.1 ATRX-C_(2193-2492)片段的扩增19-21
• 3.2 原核表达载体pET30a/ATRX-C_(2193-2492)的构建21-23
• 3.3 6 His-ATRX-C_(2193-2492)蛋白的诱导表达及其检测23-26
• 3.4 6His-ATRX-C_(2193-2492)抗体的制备26-28
• 3.5 ATRX-C_(2193-2492)抗体的初步应用28-29
• 3.6 宫颈组织中 ATRX 蛋白的表达29-31
• 第4章 实验结果31-39
• 4.1 PCR扩增ATRX-C_(2193-2492)31
• 4.2 pET30a/ATRX-C_(2193-2492)载体PCR及双酶切鉴定31-32
• 4.3 融合蛋白 6His-ATRX-C_(2193-2492)的诱导表达与纯化及鉴定32-34
• 4.4 ATRX-C_(2193-2492)抗体的鉴定34-35
• 4.5 ATRX-C_(2193-2492)抗体的初步应用35-37
• 4.6 ATRX蛋白在正常和异常宫颈组织中的表达37-39
• 第5章 讨论39-43
• 第6章 结论43-45
• 参考文献45-49
• 附件49-55
• 综述55-64
• 参考文献61-64
• 读硕期间参与课题与论文64-65
• 本研究基金资助65-66
• 致谢66

【参考文献】

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1 ;HPV阳性的扁桃体癌和舌癌患者预后较好[J];药学进展;2008年07期

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本文编号：919279