常山酮联合放射治疗对小鼠移植瘤免疫微环境影响及机制研究

发布时间：2017-09-27 13:06

  本文关键词：常山酮联合放射治疗对小鼠移植瘤免疫微环境影响及机制研究

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【摘要】：目的:探讨常山酮联合放射治疗对小鼠移植瘤免疫微环境影响,并探索其可能的机制。方法:将40只健康雌性C57BL/6J小鼠右后肢皮下接种Lewis细胞,建立Lewis肺癌移植瘤模型,接种后第6天(肿瘤长径达0.5厘米大小时)进行实验。挑选35只肿瘤负荷较相近小鼠随机分为空白对照组、常山酮组、放射治疗组、放射治疗联合常山酮组,放射治疗联合TGF-β抑制剂组,每组7只。对照组不做处理;常山酮组于接种后第6天至第15天予常山酮腹腔给药,每只鼠2ug/0.1ml/d;放射治疗组于接种后第8天、9天给予移植瘤6MV-X线照射,放射治疗剂量为10Gy×2;放射治疗联合常山酮组给药处理同常山酮组,放射治疗的时间及剂量同放射治疗组;放射治疗联合抑制剂组于接种后第6天至第15天予TGF-β抑制剂(SB431542终浓度1u M)腹腔给药,每只小鼠0.1ml/d,放射治疗处理同放射治疗组。自治疗开始每隔l天用游标卡尺测量瘤径。接种后第15天(照射结束后第6天)各组随机处死3只小鼠,取脾脏制备单细胞悬液后行FACS检测脾脏淋巴细胞中CD4+CD25+Fox P3+调节性T细胞Treg细胞含量;剥离小鼠肿瘤组织,一部分制备单细胞悬液行FACS检测肿瘤组织浸润淋巴细胞中Treg细胞含量,剩余部分福尔马林固定及冻存并通过免疫组织化学、Elisa、Western Blot等技术研究不同处理组移植瘤TGF-β信号传导通路的变化;剩余小鼠观察移植瘤生长抑制情况,并计算生存期。结果:流式结果显示:空白对照组、常山酮组肿瘤浸润淋巴细胞中Treg含量无明显差异(P=0.989),放射治疗组肿瘤浸润淋巴细胞中Treg含量较对照组明显升高(P0.001),联合应用常山酮或TGF-β抑制剂组肿瘤组织浸润淋巴细胞中Treg含量较放射治疗组明显下降(P值均0.05)。空白对照组、常山酮组脾脏Treg含量无明显差异(P=0.742),单纯放射治疗组脾脏Treg含量较空白对照组明显升高(P=0.021),放射治疗联合常山酮组及放射治疗联合TGF-β抑制剂组脾脏Treg含量较放射治疗组明显下降(P值均0.05);Elisa结果:空白对照组和常山酮组肿瘤组织中TGF-β水平无统计学差异(P=0.271),放射治疗组TGF-β水平较对照组明显升高(P=0.001),而放射治疗联合常山酮组及放射治疗联合TGF-β抑制剂组TGF-β水平较单纯放射治疗组均明显降低(P值均0.05)。免疫组织化学结果:空白对照组和常山酮组肿瘤组织中TGF-β1低表达,放射治疗组TGF-β1呈阳性表达,放射治疗联合常山酮组及放射治疗联合TGF-β抑制剂组TGF-β1低表达。Western Blot结果显示,各处理组Smad2蛋白表达无明显差异,空白对照组与常山酮组p-Smad 2蛋白表达水平无明显差异,放射治疗组p-Smad 2蛋白表达较对照组升高,放射治疗联合常山酮组及放射治疗联合抑制剂组p-Smad 2的表达较单纯放射治疗组降低;各组Smad 6蛋白表达水平亦有差异,常山酮组和空白对照组Smad 6蛋白表达无明显差异,放射治疗组Smad 6蛋白表达较对照组下降,而放射治疗联合常山酮组及放射治疗联合抑制剂组Smad 6的表达较单纯放射治疗组均升高。治疗前各组小鼠肿瘤体积无统计学差异(P=0.377),治疗后各时间点空白对照组及常山酮组小鼠肿瘤体积均无明显差异(P值均0.05),放射治疗结束后第5天,放射治疗组、放射治疗联合常山酮组及放射治疗联合TGF-β抑制剂组移植瘤体积开始小于对照组(P值分别为0.008、0.023、0.007),放射治疗组、放射治疗联合常山酮组及放射治疗联合TGF-β抑制剂组肿瘤体积无统计学差异(P值均0.5),放射治疗结束后第9天,放射治疗联合常山酮组及放射治疗联合TGF-β抑制剂组肿瘤体积开始小于放射治疗组(P值分别为0.049、0.025),治疗后各时间点放射治疗联合常山酮组及放射治疗联合TGF-β抑制剂组肿瘤体积均无明显差异(P值均0.05)。空白对照组及常山酮组小鼠生存期无统计学差异(P=0.784),OS分别为28天和34天,放射治疗组、放射治疗联合常山酮组及放射治疗联合TGF-β抑制剂组生存期均显著长于空白对照组(P值均0.05),OS分别为41天、53天、54天;放射治疗联合常山酮组及放射治疗联合TGF-β抑制剂组小鼠生存期未达到统计学差异(P=0.837),但均明显长于放射治疗组(P值均0.05)。结论:常山酮可以改善电离辐射所致的肿瘤免疫抑制状态并增强放射治疗疗效,其可能作用机制是通过抑制肿瘤细胞内TGF-β信号传导通路来实现的。
【关键词】：常山酮 放射治疗 转化生长因子-β 调节性T细胞 免疫微环境
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.5
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语/符号说明10-11
• 前言11-14
• 研究现状、成果11-12
• 研究目的、方法12-14
• 对象和方法14-26
• 1.1 材料与仪器14-16
• 1.1.1 实验细胞与动物14
• 1.1.2 试剂14-15
• 1.1.3 耗材15
• 1.1.4 照射装备及参数15
• 1.1.5 仪器设备15-16
• 1.2 实验方法16-26
• 1.2.1 试剂的配制16
• 1.2.2 细胞培养16-18
• 1.2.3 动物的饲养管理18
• 1.2.4 移植瘤模型的建立18
• 1.2.5 小鼠分组及治疗法18
• 1.2.6 小鼠肿瘤组织浸润淋巴细胞及脾脏淋巴细胞中Treg含量测定18-20
• 1.2.7 Elisa法检测小鼠肿瘤组织中TGF-β1 水平20-21
• 1.2.8 非生物素免疫组化二步法检测肿瘤组织TGF-βl表达情况21-22
• 1.2.9 Western Blot法测定smad蛋白水平22-25
• 1.2.10 统计学方法25-26
• 结果26-32
• 2.1 各组小鼠肿瘤组织及脾脏淋巴细胞中Treg细胞含量26-28
• 2.2 各组小鼠移植瘤TGF-β1 水平28-30
• 2.2.1 Elisa法检测小鼠移植瘤TGF-β1 水平28-29
• 2.2.2 免疫组织化学法检测小鼠移植瘤TGF-β1 水平29-30
• 2.3 不同处理组TGF-β/smad通路蛋白表达变化30
• 2.4 各组小鼠肿瘤生长抑制情况及生存30-32
• 讨论32-37
• 3.1 放射治疗引起肿瘤免疫微环境中Treg细胞增多32-33
• 3.2 放射治疗激活TGF-β 信号通路33-34
• 3.3 TGF-β 促进Tregs的增殖和分化，促进肿瘤的免疫逃避34-35
• 3.4 常山酮抑制放射治疗导致的TGF-β 通路激活及肿瘤免疫微环境中Treg细胞增多35-37
• 结论37-38
• 参考文献38-44
• 发表论文和参加科研情况说明44-45
• 综述45-60
• 综述参考文献53-60
• 致谢60

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本文编号：929831