TGF-β1诱导食管鳞状细胞癌细胞TE13发生上皮间质转化及其参与放射抗性的分子机制

发布时间：2017-09-29 19:38

本文关键词：TGF-β1诱导食管鳞状细胞癌细胞TE13发生上皮间质转化及其参与放射抗性的分子机制

【摘要】：目的:以体外培养的食管鳞状细胞癌细胞株TE13为实验对象,通过放射线反复照射筛选出的具有EMT样表型的放射抗性细胞株TE13R120,并利用转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)诱导TE13细胞发生上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT),建立EMT细胞模型。对TE13细胞株、EMT模型细胞和TE13R120细胞进行Real-Time PCR、Western blot、免疫细胞化学检测,测定这三株细胞株中神经营养因子受体(neurotrophin receptor p75 interacting MAGE homologue,NRAGE)基因的表达和细胞内定位情况。探讨食管癌细胞中NRAGE亚细胞定位在EMT与放射抗性形成中的作用,对深入研究食管癌细胞的恶性生物学行为具有重要意义,为放射抗性造成的放疗失败提供一种新的思路和实验依据,同时也为肿瘤治疗提供了新的靶点。方法:人食管鳞状细胞癌细胞株TE13常规培养,待细胞进入对数生长期后用于实验。实验分为三组:TE13细胞组、EMT细胞模型组、TE13R120细胞组,通过Real-Time PCR、Western blot和免疫细胞化学三种实验技术分别检测NRAGE的m RNA表达情况及总蛋白、胞浆蛋白、胞核蛋白的表达情况。其中TE13R120细胞株经过放射线反复照射筛选TE13累积剂量120Gy所得,通过细胞克隆形成实验验证其放射抗性。并通过倒置显微镜观察细胞形态学改变,通过Western blot、Real-Time PCR检测EMT相关标志物E-cadherin、Vimentin的蛋白表达和m RNA表达情况验证EMT样表型的存在。EMT细胞模型利用TGF-β1诱导TE13细胞株所得,并通过倒置显微镜观察细胞形态学改变,Western blot、Real-Time PCR检测EMT相关标志物E-cadherin、Vimentin的蛋白表达和m RNA表达情况验证是否诱导成功。统计学方法采用SPSS17.0软件包进行数据分析,计量资料以均数±标准差表示,两组之间的比较采用独立样本t检验,P0.05即认为有统计学意义。1建立放射抗性细胞株TE13R120,并验证其放射抗性及存在EMT样表型建立TE13R120细胞后,进行克隆形成实验拟合细胞存活曲线,计算TE13及TE13R120细胞放射敏感性参数D0、Dq、N值和SF2,TE13细胞分别为:2.242、0.854、1.465、0.538;TE13R120细胞分别为:2.499、1.991、2.219、0.734。倒置显微镜下观察对数生长期的单层细胞TE13细胞株和TE13R120细胞株形态学差异,TE13细胞株为不规则的多边形,细胞间边界不清,呈片状生长;而TE13R120细胞株则细长呈梭行或纺锤形,细胞极性消失。Western blot检测EMT相关标志物E-cadherin、Vimentin的蛋白表达情况,TE13细胞组的E-cadherin表达(403.526±32.684)高于TE13R120细胞组(132.291±6.542)(P0.05);TE13细胞组的Vimentin表达(86.438±4.387)低于TE13R120细胞组(400.324±5.698)(P0.05)。Real-Time PCR检测EMT相关标志物E-cadherin、Vimentin的m RNA表达情况。TE13细胞组的E-cadherin表达(1.576±0.290)高于TE13R120细胞组(0.095±0.052)(P0.05);TE13细胞组的Vimentin表达(1.015±0.236)低于TE13R120细胞组(23.145±1.131)(P0.05)。2 TGF-β1诱导食管鳞状细胞癌细胞株TE13细胞发生EMT取对数生长期的单层细胞于倒置显微镜下观察,TGF-β1(10ng/ml)刺激TE13细胞株48h后发生的形态学改变,细胞由不规则的多边形转变为纺锤形;细胞间的结合由紧密变为疏松。Western blot检测EMT相关标志物E-cadherin、Vimentin的蛋白表达情况,TE13细胞组的E-cadherin表达(403.526±32.684)高于EMT细胞模型组(156.369±5.722)(P0.05);TE13细胞组的Vimentin表达(86.438±4.387)低于EMT细胞模型组(389.324±9.378)(P0.05)。Real-Time PCR检测EMT相关标志物E-cadherin、Vimentin的m RNA表达情况。TE13细胞组的E-cadherin表达(1.576±0.290)高于EMT细胞模型组(0.213±0.142)(P0.05);TE13细胞组的Vimentin表达(1.015±0.236)低于EMT细胞模型组(22.848±0.211)(P0.05)。3 NRAGE在三组细胞中的表达情况通过Real-Time PCR、Western blot、免疫细胞化学技术对NRAGE在TE13细胞组、EMT细胞模型组、TE13R120细胞组中的表达情况进行检测。Real-Time PCR检测NRAGE的m RNA表达情况,TE13细胞组(1.6826±0.749)分别低于EMT细胞模型组(5.253±0.916)(P0.05)和TE13R120细胞组(5.562±2.212)(P0.05);EMT细胞模型组与TE13R120细胞组之间无差别(P0.05)。Western blot检测NRAGE的蛋白表达情况,TE13细胞组(34.408±3.267)分别低于EMT细胞模型组(160.327±15.797)(P0.05)和TE13R120细胞组(163.472±13.583)(P0.05);EMT细胞模型组与TE13R120细胞组之间无差别(P0.05)。进一步运用Western blot检测NRAGE在胞浆和胞核中蛋白表达情况。通过对三组细胞胞浆中NRAGE蛋白表达情况进行两两比较,三者比较均无差别(P(TE13 VS.EMT)0.05、P(TE13 VS.TE13R120)0.05、P(TE13R120 VS.EMT)0.05);两两比较在胞核中表达情况是否存在差别:TE13细胞组(45.384±3.680)分别低于EMT细胞模型组(198.345±26.265)和TE13R120细胞组(210.589±30.211),且均具有统计学意义(P(TE13 VS.EMT)0.05、P(TE13 VS.TE13R120)0.05),EMT细胞模型组与TE13R120细胞组间则无统计学意义(P0.05)。免疫细胞化学检测NRAGE在三组细胞中定位及胞浆胞核表达情况,三组细胞胞浆中的表达情况无明显差别(P(TE13 VS.EMT)0.05、P(TE13 VS.TE13R120)0.05、P(TE13R120 VS.EMT)0.05),胞核中EMT细胞模型组和TE13R120细胞组表达明显多于TE13细胞组(P(TE13 VS.EMT)0.05、P(TE13 VS.TE13R120)0.05),而EMT细胞模型组和TE13R120细胞组间则无明显差别(P0.05)。结论:1 NRAGE亚细胞定位参与放射抗性的形成;2 EMT参与NRAGE亚细胞定位从而促进放射抗性的形成。
【关键词】：食管鳞状细胞癌 放射抗性 上皮间质转化 NRAGE TGF-β1
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.1
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