Gab2对结直肠癌细胞增殖、侵袭转移的影响及其潜在机制研究

发布时间：2017-09-30 04:09

  本文关键词：Gab2对结直肠癌细胞增殖、侵袭转移的影响及其潜在机制研究

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【摘要】：目的:检测Gab2在结直肠癌组织中的表达情况,分析其与临床病理参数的相关性;在基因和蛋白水平上检测不同结直肠癌细胞株中Gab2的表达情况,用携带Gab2基因过表达及基因沉默慢病毒载体感染结直肠癌细胞株,获取Gab2过表达和基因沉默稳定感染细胞株;通过体内外实验探讨Gab2在结直肠癌细胞增殖、侵袭及转移等生物学特性中发挥的作用;检测Gab2下游关键信号蛋白磷酸化水平的表达情况,研究Gab2可能参与调控结直肠癌细胞增殖、侵袭转移的信号通路。方法:一、结直肠癌组织中Gab2表达与临床病理参数的关系收集手术切除的109例结直肠癌标本(包括27例配对冰冻组织和82例石蜡包被组织),q RT-PCR及Western blot分别检测冰冻组织中Gab2 m RNA和蛋白的表达情况;免疫组化检测82例石蜡包被组织中Gab2蛋白表达情况,并统计分析Gab2表达与病人临床资料间相关性。二、Gab2在结直肠癌细胞中的表达与细胞增殖、迁移和侵袭的关系1.Gab2在不同结直肠癌细胞株中的差异表达研究:运用q RT-PCR和Western blot检测不同结直肠癌细胞株中Gab2的表达情况,从基因水平和蛋白水平筛选出低表达和高表达Gab2的结直肠癌细胞株。2.慢病毒载体感染结直肠癌细胞株及验证实验:将Gab2过表达及其相对应的空载对照慢病毒载体分别感染SW480,并设为LV-Gab2和LV-Control两组,Gab2基因沉默及其相对应的空载对照慢病毒载体分别感染SW620,并设为LV-sh Gab2和sh RNA-Control两组;感染72h后,运用q RT-PCR和Western blot分别检测感染后细胞中Gab2 m RNA和蛋白的表达。3.Gab2调节结直肠癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的研究:用CCK-8和克隆形成试验分别检测各感染细胞增殖活性、克隆形成能力,Transwell迁移和侵袭实验分别检测细胞迁移、侵袭能力的变化,体外观察Gab2在结直肠癌细胞增殖、迁移及侵袭中的作用。三、体内验证Gab2对结直肠癌细胞增殖和转移能力的影响1.裸鼠成瘤实验:24只BALB/c裸鼠(5-6周龄)随机分成四组,每组6只,背部皮下接种上述四组感染细胞后,观察Gab2表达对肿瘤细胞裸鼠成瘤的影响,包括成瘤瘤体体积和重量的差异,从而在体内进一步验证Gab2对结直肠癌细胞生长增殖能力的影响。2.体内转移形成实验:24只BALB/c裸鼠(5-6周龄)随机分成四组,每组6只,尾静脉注射上述感染细胞后,观察Gab2表达对肿瘤细胞转移的影响,包括小鼠肝肺转移比率及转移脏器中肿瘤结节的数量,从而在体内进一步验证Gab2对结直肠癌细胞转移能力的影响。四、Gab2参与结直肠癌细胞增殖、侵袭转移的信号传导通路研究慢病毒载体感染结直肠癌细胞株后,首先倒置显微镜下观察Gab2表达对细胞形态学变化的影响;q RT-PCR、Western blot及细胞免疫荧光检测上述感染细胞中E-cadherin、Vimentin m RNA和蛋白的表达情况,并运用Western blot检测各组细胞中转移相关因子MMP-7、MMP-9蛋白的表达情况,探讨Gab2是否调控EMT程序,进而影响结直肠癌细胞迁移和侵袭能力;随后Western blot检测下游关键信号分子ERKl/2和AKT在Gab2上调及干扰前后蛋白磷酸化水平的变化,初步探讨ERK及AKT信号通路是否参与了Gab2对结直肠癌细胞的增殖、侵袭及转移的调控作用;最后使用化学拮抗剂阻断相关信号通路,明确Gab2参与调控结直肠癌细胞的增殖、侵袭及转移的信号传导通路。结果:一、与配对癌旁正常组织相比,结直肠癌组织中Gab2 mRNA(P=0.014)和蛋白(P=0.003)的表达水平均显著上调;免疫组化结果显示,Gab2蛋白在癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织(P0.05),且与淋巴结转移、远处浸润及临床分期密切相关。二、从基因和蛋白水平均表明,与低侵袭性细胞株HT29、SW480或人正常肠上皮细胞FHC相比,Gab2在高侵袭性细胞株SW620及LOVO中显著上调;与对照组相比,LV-Gab2组细胞Gab2蛋白和m RNA的表达显著上调(P0.05),LV-sh Gab2组细胞Gab2蛋白和m RNA的表达明显下调(P0.05),表明成功建立Gab2基因过表达及沉默稳定感染细胞株;Gab2基因上调可显著增强SW480细胞的增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力(P0.05);相反,Gab2基因沉默可明显抑制SW620细胞的增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力(P0.05)。三、裸鼠皮下接种成瘤实验发现,Gab2基因上调可显著促进肿瘤形成,瘤体积和体重呈明显上调(P0.05);而Gab2基因沉默可明显抑制肿瘤形成,瘤体积和体重呈显著下调(P0.05)。裸鼠尾静脉注射实验发现,Gab2基因过表达后,小鼠肝肺转移比率及肝肺肿瘤结节数目显著上调(P0.05);而Gab2基因沉默后,小鼠肝肺转移比率及肝肺肿瘤结节数目明显下降(P0.05)。四、Gab2基因过表达后,SW480细胞由上皮细胞形态转变为间质细胞形态,EMT上皮标记蛋白E-cadherin蛋白及m RNA表达水平显著下降(P0.05),而间质标记蛋白Vimentin蛋白及m RNA表达明显增加(P0.05),同时转移相关因子MMP-7和MMP-9蛋白表达水平显著上调(P0.05);Gab2基因沉默后,SW620细胞由间质细胞形态转变为上皮细胞形态,E-cadherin蛋白及m RNA表达水平显著上调(P0.05),而Vimentin蛋白及m RNA表达明显下降(P0.05),同时转移相关因子MMP-7和MMP-9蛋白表达水平显著下调(P0.05);Gab2基因过表达后,phospho-ERKl/2表达水平明显增加(P0.05),phospho-AKT表达水平并未发生明显变化(P0.05);而Gab2基因沉默后,phospho-ERKl/2表达水平显著下降(P0.05),phospho-AKT表达水平并未发生显著变化(P0.05);LV-Gab2细胞使用U0126后,phospho-ERKl/2、Vimentin、MMP-7和MMP-9表达水平明显下降(P0.05),而E-cadherin表达水平部分恢复(P0.05),同时细胞的增殖、迁移及侵袭能力显著减弱(P0.05)。结论:一、Gab2在结直肠癌组织及细胞株中表达上调。二、Gab2在体内外都可以显著促进结直肠癌细胞的增殖、侵袭及转移能力。三、Gab2可能通过调控EMT程序来增强结直肠癌细胞的侵袭和转移能力。四、Gab2主要通过MEK/ERK1/2信号通路参与结直肠癌细胞增殖、侵袭转移的调控。
【关键词】：结直肠癌 Gab2 增殖 转移 信号通路
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.34
【目录】：

• 中文摘要8-11
• Abstract11-16
• 前言16-19
• 第一部分 Gab2在结直肠癌组织中的表达与临床资料相关性19-30
• 引言19
• 1 材料与方法19-25
• 2 结果25-28
• 3 讨论28-30
• 第二部分 Gab2对结直肠癌细胞增殖、迁移及侵袭转移的作用和影响30-51
• 引言30
• 1 材料与方法30-37
• 2 结果37-48
• 3 讨论48-51
• 第三部分 Gab2调控结直肠癌细胞增殖、侵袭转移的分子作用机制51-66
• 引言51
• 1 材料与方法51-54
• 2 结果54-64
• 3 讨论64-66
• 结论66-68
• 参考文献68-73
• 综述73-85
• 参考文献80-85
• 致谢85-87
• 作者简介87-88

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本文编号：946038