磷酸果糖激酶相关微小RNA影响肿瘤细胞糖代谢的机制研究

发布时间：2017-09-30 06:24

  本文关键词：磷酸果糖激酶相关微小RNA影响肿瘤细胞糖代谢的机制研究

  更多相关文章： 微小RNA128 肝型磷酸果糖激酶 肺癌 糖酵解 代谢

【摘要】：背景及意义癌症是严重威胁人类健康的恶性疾病之一。在所有癌症中,肺癌是男性死亡人数最多、女性死亡人数高居第二位的恶性肿瘤。与正常细胞通过线粒体进行氧化磷酸化不同的是,癌细胞主要通过糖酵解过程获得生命活动所需要的能量,产生大量乳酸和少量ATP,这种现象被称作瓦博格效应(Warburg effect)。磷酸果糖激酶(phosphofructokinase, PFK)是糖酵解途径中最关键的限速酶,它能够催化6-磷酸果糖反应生成1,6-二磷酸果糖。微小RNA (microRNA, miRNA)是一类内源性的、在进化上非常保守的、其长度约为22个核苷酸的非编码小RNA。经过一系列加工,成熟的miRNA能够完全或不完全地与nRNA的3'端非翻译区结合,通过抑制翻译或使得靶向mRNA降解来调节基因表达。越来越多的研究表明,niRNA在肿瘤的发生、发展中具有重要的作用；除了能够抑制癌细胞的增殖、促进癌细胞的凋亡外,miRNA还能通过调控糖代谢途径中的酶,来调节糖代谢途径,但是否存在niRNA通过靶向PFK,从而调控癌细胞糖酵解途径,目前尚不清楚。本研究旨在阐明PFK相关miRN A调控肺癌细胞糖代谢的机制,为分子靶向药物的研发提供理论依据。方法(1)通过查阅、分析文献,筛选出适合于进一步研究的肝型磷酸果糖激酶(PFK liver type, PFKL) 。(2)运用生物信息学方法筛选,发现miR-128与PFKL之间存在潜在的靶点关系。(3)根据miRNA合成原则,设计合成miR-128的mimics、inhibitor及其对应的阴性对照。用Lipofectamine 2000装miR-128的mimics和inhibitor分别转染NCI-H460 及 NCI-H1299细胞,以分别升高或降低细胞中miR-128的水平。运用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析转染后,miR-128在细胞中的表达变化,以确认转染效果。(4)用qRT-PCR分析转染相对应的RNAs之后,细胞内PFKL在nRNA水平的表达变化；Western blot分析PFKL在蛋白水平的表达变化。(5)通过双荧光素酶报告分析系统,进一步确认niR-128与PFKL之间的靶点关系。(6)运用MTT、结晶紫染色法分别分析转染RNAs之后,对细胞生长及克隆形成的影响；荧光光度法分析转染RNAs之后,对细胞内ATP含量变化的影响；分光光度法分析转染RNAs之后,对细胞葡萄糖摄入量和乳酸生成量的影响。评价miR-128表达水平的变化对肺癌细胞糖代谢的影响。(7) qRT-PCR分析干扰AKT信号通路对miR-128及PFKL表达的影响。(8)通过Western blot分析异常表达miR-128之后,对总AKT及磷酸化AKT表达量的影响,分析niR-128调控糖酵解的机制。结果(1)PFKL在肺癌细胞NCI-H460中相对高表达；miR-128在NCI-H1299中相对高表达；miR-128的表达与PFKL的表达呈负相关。(2)生物信息学筛选发现,PFKL是miR-128的潜在靶点,双荧光素酶报告分析进一步验证了它们之间存在的靶点关系。同时,miR-128表达水平上调能抑制PFKL在mRNA水平及蛋白水平的表达；反之,抑制miR-128的表达,则能促进PFKL在mRNA水平及蛋白水平的表达。共转染miR-128与PFKL的过表达载体,能够补救由miR-128引起的PFKL的表达下降。(3)上调miR-128的表达能够抑制肺癌细胞的生长以及克隆的形成；而抑制miR-128的表达,则能促进肺癌细胞的生长以及克隆的形成；干扰PFKL的表达能够抑制肺癌细胞的生长以及克隆的形成,过表达PFKL能够促进肺癌细胞的生长以及克隆的形成。(4)在临床患病样本中,PFKL的表达显著高于正常样本；而miR-128在临床患病样本中的表达则显著低于正常样本；在临床患病样本中,miR-128的表达与PFKL的表达呈负相关。(5)上调miR-128的表达能够使得肺癌细胞内ATP含量增加、葡萄糖摄入量减少以及乳酸生成量减少；而抑制miR-128的表达,则使得肺癌细胞内ATP含量减少、葡萄糖摄入量增加以及乳酸生成量增加；干扰PFKL的表达能够使得肺癌细胞内ATP含量增加、葡萄糖摄入量减少以及乳酸生成量减少,过表达PFKL能够减少肺癌细胞内ATP含量,增加葡萄糖摄入量以及乳酸生成量。(6)干扰AKT信号通路能够促进miR-128的表达；相反,干扰AKT信号通路则显著抑制PFKL在mRNA水平的表达。(7)过表达miR-128能够显著降低磷酸化AKT的表达；相反,抑制miR-128的表达对磷酸化AKT的表达无明显影响；异常表达的miR-128对总AKT水平无明显影响。结论本研究阐明了miR-128与PFKL之间的靶点调控机制,进一步验证了miRNAs对糖酵解途径中关键限速酶的调控作用。同时,研究表明,miR-128通过调控糖酵解途径中的最为关键的限速酶PFKL (PFK liver type),从而对肺癌细胞内ATP含量、肺癌细胞葡萄糖摄入量以及乳酸生成量产生影响。我们的研究结果还表明,miR-128对糖酵解过程的调节,可能是通过AKT信号通路来完成的。这些结果说明,miRNA在肺癌细胞的糖酵解途径中起着重要的作用；同时,miR-128可能作为肺癌治疗的新靶点。
【关键词】：微小RNA128 肝型磷酸果糖激酶 肺癌 糖酵解 代谢
【学位授予单位】：宁波大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.2
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 引言13-15
• 1 实验方案设计15-20
• 1.1 实验的目的及意义15
• 1.2 研究内容15-16
• 1.2.1 miR-128的靶点确认分析15
• 1.2.2 miR-128及PFKL在肺癌细胞中的初始表达分析15
• 1.2.3 miR-128对PFKL的表达调控分析15
• 1.2.4 异常表达miR-128或PFKL对细胞生长以及克隆形成的影响15-16
• 1.2.5 临床样本分析16
• 1.2.6 PFKL表达量与患者总体生存率的相关性分析16
• 1.2.7 异常表达miR-128或PFKL对细胞葡萄糖摄入及乳酸生成的影响16
• 1.2.8 异常表达miR-128或PFKL对细胞内ATP含量的影响16
• 1.2.9 miR-128作用于PFKL的机制分析16
• 1.3 技术路线图16-17
• 1.4 实验方案17-20
• 1.4.1 肺正常上皮细胞及肺癌细胞的培养17-18
• 1.4.2 细胞总RNA提取及qRT-PCR18
• 1.4.3 双荧光素酶报告分析18
• 1.4.4 miR-128对PFKL的蛋白调控分析18
• 1.4.5 MTT分析18
• 1.4.6 结晶紫染色法18
• 1.4.7 临床血液样本中PFKL及miR-128表达分析18
• 1.4.8 KM-plot分析18
• 1.4.9 葡萄糖摄入量及乳酸生成量的测定18
• 1.4.10 ATP含量的测定18-19
• 1.4.11 miR-128调控PFKL的作用机制分析19
• 1.4.12 数据总结分析19-20
• 2 实验材料与方法20-42
• 2.1 实验材料20-30
• 2.1.1 主要实验仪器20-21
• 2.1.2 主要试剂耗材21-24
• 2.1.3 实验细胞株、菌株及载体24
• 2.1.4 肺癌患者及健康志愿者血液样本收集24
• 2.1.5 主要试剂及配制24-30
• 2.2 实验方法30-42
• 2.2.1 细胞培养和传代30
• 2.2.2 细胞复苏30-31
• 2.2.3 细胞冻存31
• 2.2.4 细胞计数31
• 2.2.5 合成RNAs31
• 2.2.6 转染RNAs31-32
• 2.2.7 总RNA提取32
• 2.2.8 RNA纯度分析32
• 2.2.9 逆转录反应32-33
• 2.2.10 质粒的构建33-35
• 2.2.11 无内毒素质粒提取35
• 2.2.12 双荧光素酶报告分析相关操作35-36
• 2.2.13 普通PCR和qRT-PCR36-38
• 2.2.14 Western blot检测蛋白表达38-39
• 2.2.15 MTT分析细胞生长情况39-40
• 2.2.16 细胞克隆形成实验40
• 2.2.17 临床血液样本中PFKL及miR-128表达测定40
• 2.2.18 KM-plot分析相关操作40
• 2.2.19 细胞葡萄糖摄入量的测定40
• 2.2.20 细胞内乳酸含量的测定40
• 2.2.21 细胞内ATP含量测定40
• 2.2.22 miR-128调控PFKL的机制分析40
• 2.2.23 统计方法40-42
• 3 实验结果42-59
• 3.1 筛选出PFKL相关的miRNA42
• 3.2 成功构建PFKL 3’UTR野生型及突变型载体42-43
• 3.3 PFKL是miR-128的直接靶点43-45
• 3.4 PFKL在NCI-H460中相对高表达,miR-128在NCI-H1299中相对高表达45
• 3.5 成功构建PFKL过表达载体45-46
• 3.6 miR-128抑制PFKL在mRNA及蛋白水平的表达46-49
• 3.7 过表达PFKL能够补救由miR-128引起的PFKL mRNA水平降低49-50
• 3.8 过表达PFKL能够补救由miR-128引起的PFKL蛋白水平的降低50-51
• 3.9 miR-128能够抑制肺癌细胞的生长及克隆的形成51-52
• 3.10 miR-128的表达与PFKL的表达呈负相关52-54
• 3.11 miR-128介导代谢方式的转变54-56
• 3.12 miR-128通过AKT信号通路来调控PFKL56-57
• 3.13 异常表达miR-128对AKT在mRNA水平的表达无明显影响57-59
• 4 结论59-61
• 5 讨论61-63
• 参考文献63-66
• 附录A 缩写表66-68
• 附录B 综述68-80
• 参考文献75-80
• 在学研究成果80-82
• 致谢82

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本文编号：946652