烟草提取物诱导人肺腺癌细胞株PC-9吉非替尼耐药相关机制及对克服耐药的探索

发布时间：2017-10-01 22:37

  本文关键词：烟草提取物诱导人肺腺癌细胞株PC-9吉非替尼耐药相关机制及对克服耐药的探索

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【摘要】：目的探讨烟草提取物(cigarette smoke extract,CSE)诱导EGFR敏感性突变人肺腺癌细胞株PC-9吉非替尼耐药的可能相关分子机制及乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)能否逆转CSE诱导的PC-9细胞吉非替尼耐药。方法以不同浓度CSE处理PC-9细胞不同时间,检测其上皮间质转化相关标志物(epithelial to mesenchymal transition,EMT)E-cadherin、Vimentin表达,筛选出合适的工作时间及工作浓度。观察CSE暴露(10%CSE组)、Src抑制剂PP2预处理后CSE暴露(PP2+10%CSE组)、NAC预处理后CSE暴露(NAC+10%CSE组)对PC-9细胞E-cadherin、Vimentin及EMT相关信号通路蛋白、mRNA表达,PC-9对吉非替尼敏感性,细胞形态学及侵袭迁移能力等的影响。以qRT-PCR法检测E-cadherin、Vimentin mRNA表达;Western blot法检测E-cadherin、Vimentin、Src、p-Src蛋白表达;细胞免疫荧光法检测细胞形态学及E-cadherin、Vimentin的定位、半定量;CCK-8法检测吉非替尼及NAC对细胞增殖抑制情况;Transwell法检测细胞侵袭能力;划痕实验检测细胞迁移能力。结果qrt-pcr结果显示:随着cse浓度的增加(0,2.5%cse,5%cse,10%cse)暴露时间的延长(0,24h,48h,72h),pc-9细胞e-cadherin表达逐渐减少,vimentin表达逐渐增加,筛选出后续实验cse浓度为10%cse,暴露时间为72h。10%cse组e-cadherinmrna相对表达水平显著低于空白对照组(p0.001),vimentinmrna相对表达水平显著高于空白对照组(p0.001)。pp2+10%cse组及nac+10%cse组e-cadherinmrna相对表达水平均明显高于10%cse组(p均0.01);vimentinmrna相对表达水平均明显低于10%cse组(p均0.001)。westernblot结果显示:e-cadherin、vimentin蛋白表达情况与qrt-pcr结果一致。p-src蛋白表达量在10%cse组明显高于空白对照组;而pp2+10%cse组、nac+10%cse均明显低于10%cse组。细胞免疫荧光结果显示:vimentin表达于细胞质,e-cadherin表达于细胞膜,e-cadherin、vimentin表达量与qrt-pcr及westernblot结果一致。10%cse组pc-9细胞由上皮样形状变成长梭形、纺锤形;而pp2+10%cse组、nac+10%cse组pc-9细胞仍呈上皮样形状。cck-8实验结果显示:nac对pc-9细胞的无毒剂量为5mm。吉非替尼对空白对照组、10%cse组、pp2+10%cse组、nac+10%cse组pc-9细胞的ic50分别为(0.0566±0.0060)μm、(0.8340±0.2780)μm、(0.1380±0.0878)μm、(0.1650±0.0242μm],其中10%cse组明显高于空白对照组(p0.01),而pp2+10%cse组及nac+10%cse组则明显低于10%cse组(p均0.05)。Transwell实验结果显示:10%CSE组穿膜细胞数明显高于空白对照组(p0.0001),PP2+10%CSE组及NAC+10%CSE组穿膜细胞数明显低于10%CSE组(p均0.0001)。划痕实验结果显示:10%CSE组PC-9细胞迁移距离明显大于空白对照组;PP2+10%CSE组、NAC+10%CSE组PC-9细胞迁移距离明显小于10%CSE组。结论1.CSE可诱导PC-9肺腺癌细胞发生EMT,且呈时间依赖性、浓度依赖性;2.CSE可诱导PC-9肺腺癌细胞吉非替尼耐药;3.Src激活在CSE诱导的PC-9肺腺癌细胞EMT过程中发挥重要作用;4.EMT和Src激活是CSE诱导的PC-9肺腺癌细胞吉非替尼耐药的重要分子机制;5.NAC可通过抑制Src激活逆转EMT克服CSE诱导的PC-9肺腺癌细胞吉非替尼耐药。
【关键词】：烟草提取物 肺癌 吉非替尼 Src 上皮间质转化
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-15
• 第一部分 烟草提取物诱导人肺腺癌细胞株PC-9 吉非替尼耐药及相关机制研究15-36
• 1 引言15
• 2 材料与方法15-24
• 3 结果24-33
• 4 讨论33-36
• 第二部分 乙酰半胱氨酸逆转CSE诱导的PC-9 细胞吉非替尼耐药36-44
• 1 引言36
• 2 材料与方法36-38
• 3 结果38-43
• 4 讨论43-44
• 全文总结44-45
• 参考文献45-50
• 文献综述50-62
• 参考文献56-62
• 致谢62-63
• 硕士期间发表的文章63

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本文编号：956097