在人间充质干细胞及癌细胞内Oct4的表达及其DNA甲基化的研究

发布时间：2017-10-04 04:02

  本文关键词：在人间充质干细胞及癌细胞内Oct4的表达及其DNA甲基化的研究

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【摘要】：目的:研究Oct4在人间充质干细胞和几种癌细胞中的表达及其DNA甲基化对Oct4表达调控的作用。方法:1.采用组织块法和梯度离心法分别分离UC-MSCs和BM-MSCs;2.通过成骨和成脂诱导分化实验鉴定MSCs的多向分化潜能;3.采用流式细胞术鉴定MSCs的表面抗原;4.分别采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)、细胞免疫荧光(ICC)和流式细胞术(FACS)检测Oct4基因在hIPS、UC-MSCs、BM-MSCs、DU145、PC-3、MCF-7、HeLa、293T细胞内的表达;5.采用甲基化特异性PCR分析Oct4调控区域的CpG位点的甲基化状态。结果:1.采用组织块法和梯度离心分别分离了UC-MSCs和BM-MSCs;2.通过成骨和成脂诱导分化实验将MSCs诱导分化为成骨和成脂细胞,确认了MSCs具有多向分化潜能;3.采用流式细胞术鉴定了MSCs的表面抗原,结果表明MSCs阳性标记基因的表达水平均超过95%,同时阴性标记基因的表达水平均低于2%,确认了分离的MSCs;4.Real-Time PCR表明检测的细胞均能表达Oct4 mRNA;ICC和FACS实验表明检测的细胞均能表达Oct4蛋白质;5.甲基化分析发现,在Oct4转录起始位点上游的三个关键顺式调控区域内,hIPS呈现低甲基化,而MSCs呈现中度甲基化,其他所研究的细胞均处于高度甲基化;而在Oct4转录起始位点下游的一段DNA区域内(+37~+546),UC-MSCs细胞处于中度甲基化,而其他细胞(包括hIPS)均处于较高的甲基化状态。结论:1.分离的MSCs具有多向分化潜能,且能表达MSCs特异性表面标记蛋白;2.Oct4在成体干细胞和多种人癌细胞系中均可表达;3.DNA甲基化参与Oct4基因在人MSCs和癌细胞内的表达调控,且在UC-MSCs和BM-MSCs内DNA甲基化对Oct4基因的调节机制可能不同。
【关键词】：Oct4 间充质干细胞 癌症 DNA甲基化
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.2
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 1 前言9-23
• 1.1 间充质干细胞的概述9-13
• 1.1.1 间充质干细胞的定义9
• 1.1.2 间充质干细胞的特性9-10
• 1.1.3 间充质干细胞的体外多向分化10-11
• 1.1.4 间充质干细胞的微环境11
• 1.1.5 间充质干细胞在治疗中的应用11-13
• 1.2 Oct4基因的简介13-19
• 1.2.1 Oct4基因13-14
• 1.2.2 Oct4基因内各种调控元件参与其表达调控14
• 1.2.3 OCT4在体细胞重编程中的关键作用14-15
• 1.2.4 OCT4的功能受到选择性剪切和翻译后修饰的调控15-16
• 1.2.5 OCT4在间充质干细胞中的作用16-18
• 1.2.6 OCT4在癌症中的作用18-19
• 1.3 DNA甲基化的概述19-23
• 1.3.1 DNA甲基化的简介19
• 1.3.2 DNA甲基化的功能及作用机制19-20
• 1.3.3 DNA甲基化的研究方法20-23
• 2 材料与方法23-42
• 2.1 实验材料23-28
• 2.1.1 实验仪器23-24
• 2.1.2 主要实验试剂24-26
• 2.1.3 溶液配制26-28
• 2.2 实验方法28-42
• 2.2.1 UC-MSCs原代分离28-29
• 2.2.2 BM-MSCs原代分离29-30
• 2.2.3 UC-MSCs传代培养30-31
• 2.2.4 MSCs冻存31
• 2.2.5 MSCs解冻复苏31
• 2.2.6 其他细胞培养31
• 2.2.7 UC-MSCs成骨分化31-32
• 2.2.8 茜素红染色32
• 2.2.9 ALP染色32
• 2.2.10 UC-MSCs成脂分化32-33
• 2.2.11 油红O染色33
• 2.2.12 流式细胞术33
• 2.2.13 细胞总RNA提取33-34
• 2.2.14 DNase I处理总RNA34
• 2.2.15 将处理后的RNA反转录成cDNA34-35
• 2.2.16 Real-Time PCR35-36
• 2.2.17 ICC实验36
• 2.2.18 基因组DNA提取36-37
• 2.2.19 对提取的基因组 DNA 进行化学处理37
• 2.2.20 甲基化特异性PCR37-38
• 2.2.21 DNA琼脂糖凝胶电泳及PCR产物切胶回收38-39
• 2.2.22 DNA克隆及测序39-41
• 2.2.23 统计学分析41-42
• 3 结果42-52
• 3.1 UC-MSCs的分离和形态42-43
• 3.2 BM-MSCs的分离43-44
• 3.3 UC-MSCs的成脂分化44
• 3.4 UC-MSCs的成骨分化44-45
• 3.5 UC-MSCs的流式细胞术鉴定45-46
• 3.6 Real-Time PCR检测Oct4在各种细胞中的表达46-47
• 3.7 流式细胞术（FACS）检测Oct4在各种细胞中的表达47-48
• 3.8 细胞免疫荧光（ICC）检测Oct4在各种细胞中的表达48-49
• 3.9 各种细胞Oct4调控区域的DNA甲基化检测49-52
• 4 讨论52-55
• 5 结论55-56
• 参考文献56-67
• 在校期间发表论文情况67-68
• 致谢68

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本文编号：968466