纳米羟基磷灰石负载p53基因及阿霉素对肝癌干细胞抑制效果研究

发布时间：2017-10-04 06:30

  本文关键词：纳米羟基磷灰石负载p53基因及阿霉素对肝癌干细胞抑制效果研究

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【摘要】：原发性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的恶性肿瘤之一,以其高复发和高转移率,成为死亡率居全球第三的疾病。肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)是肿瘤起始、演进、转移及复发的根源。而目前癌症的治疗手段都是针对普通肿瘤细胞,需寻求一种杀伤肿瘤干细胞的有效疗法,达到肿瘤根治的目的。基因治疗中常采用的p53是细胞周期调控的重要基因,能诱使基因突变或损伤的细胞发生凋亡。多种肿瘤的发生伴随着p53基因的突变,并与CSCs低分化特性相关。阿霉素是一种广谱性化疗药物,能插入DNA,使其发生错配而阻碍DNA的复制和转录。但除了其无特异性对正常组织细胞产生细胞毒性外,阿霉素因CSCs的多药耐药性使其无法进入CSCs细胞发挥药效。纳米材料因其独特尺寸、电荷、表面化学作为基因和药物载体用于杀伤CSCs的研究已受到广泛关注。纳米材料作为药物载体能克服肿瘤多药耐药,同时减少药物对正常组织的毒副作用。而羟基磷灰石(hydroxyapatite,HAp)是脊椎动物牙齿和骨骼的主要成分,其表面带正电,使其能通过静电吸附与带负电荷的基因结合。除了具备纳米材料的共性外,优越的生物相容性和生物降解性是其作为基因和药物载体又一优势。HAp负载p53基因和Dox具有巨大潜能改善肿瘤治疗现状。方法:1.用两种不同体系制备方法制备纳米HAp-1和HAp-2,通过场发射扫描电镜(FE-SEM)、X射线衍射(XRD)、傅里叶红外光谱(FTIR)、热失重分析(TG)等方法对两种方法制备的纳米HAp粒径、颗粒形貌、和结晶度等性质进行表征。并用聚醚酰亚胺(Polyetherimide,PEI)对其进行修饰。2.对PEI修饰的HAp复合物进行生物相容性、对p53基因与阿霉素的负载效率和降解性能进行评估。3.用MTT法、克隆形成和hoechst33258染色等方法综合评估HP-p53-Dox对采用无血清培养基体外悬浮培养法所富集的肝癌CSCs杀伤效果。结果:1.采用化学沉淀法通过PEG调控,经PEI修饰后,得到HP-1和HP-2。采用场发射扫描电子显微镜、傅立叶红外光谱、X射线衍射和热重分析对其进行表征和分析,得出的HP-1和HP-2的主要成分和晶型都为羟基磷灰石,HP-1为短棒状,长径为20-50 nm,短径约为20 nm;HP-2为球形纳米颗粒,粒径在30 nm左右。2.两种反应体系所制备的纳米羟基磷灰石颗粒以及经PEI修饰的HP均有良好的生物相容性,对肝正常细胞L-02和肝癌细胞Huh-7、Hep-3B以及乳腺癌MCF-7细胞皆无明显细胞毒性。在对p53基因负载研究中发现,HP-1具有更高的负载量。HP-p53对阿霉素的负载量随阿霉素浓度升高而增加。在降解实验中HP-1表现出优越的可降解性能,在pH为5.6、6.5、7.4 PBS中90天降解率分别为78%、60%和54%。3.HP-p53-Dox处理后的肝癌CSCs存活率显著下降,克隆形成率也明显降低。用Hoechst 33258染色观察到HP-p53-Dox处理后的CSC细胞核出现高亮光斑,细胞密度远低于对照组。
【关键词】：羟基磷灰石 肿瘤干细胞 p53 阿霉素
【学位授予单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 缩略词8-12
• 第一章 绪论12-19
• 1.1 引言12-13
• 1.2 肝癌干细胞的生物学特性13-17
• 1.2.1 肝癌干细胞识别13-14
• 1.2.2 肝癌干细胞的异质性14-15
• 1.2.3 肝癌CSC的基因表达15-17
• 1.3 纳米材料用于肿瘤干细胞的治疗17-18
• 1.3.2 纳米材料作为基因和药物载体17-18
• 1.4 本课题研究内容18-19
• 第二章 羟基磷灰石纳米颗粒的制备、改性及表征19-26
• 2.1 引言19
• 2.2 材料和方法19-23
• 2.2.1 实验材料19-21
• 2.2.2 实验方法21-23
• 2.3 实验结果23-25
• 2.3.1 HP-1 纳米羟基磷灰石改性及表征结果23-24
• 2.3.2 HP-2 纳米羟基磷灰石改性及表征结果24-25
• 2.4 本章小结25-26
• 第三章 纳米羟基磷灰石颗粒的生物相容性、降解性和负载率分析26-40
• 3.1 引言26
• 3.2 材料与方法26-35
• 3.2.1 实验材料26-30
• 3.2.2 实验方法30-35
• 3.3 实验结果35-39
• 3.3.1 pEGFP-C1-p53酶切结果35
• 3.3.2 纳米羟基磷灰石对p53基因的负载效率35-36
• 3.3.3 HP-p53对阿霉素的负载量测定结果36-37
• 3.3.4 羟基磷灰石颗粒体外降解研究37-38
• 3.3.5 纳米羟基磷灰石的生物相容性实验结果38-39
• 3.4 本章小结39-40
• 第四章 体外悬浮培养富集肝癌干细胞40-47
• 4.1 引言40
• 4.2 材料与方法40-45
• 4.2.1 实验材料40-43
• 4.2.2 实验方法43-45
• 4.3 实验结果45-46
• 4.3.1 体外悬浮微球体培养富集肝癌干细胞结果45-46
• 4.3.2 Western blot检测肝癌干细胞相关基因的表达46
• 4.4 本章小结46-47
• 第五章 HAp-p53-Dox对肿瘤干细胞杀伤效果研究47-54
• 5.1 引言47
• 5.2 材料与方法47-49
• 5.2.1 实验材料47-48
• 5.2.2 实验方法48-49
• 5.3 实验结果49-52
• 5.3.1 MTT法检测HP-p53-Dox对肝癌干细胞杀伤效果49-50
• 5.3.2 克隆形成检测HP-p53-Dox对肝癌干细胞增殖的抑制结果50-51
• 5.3.3 hoechst 33258染色检测HP-p53-Dox诱导肝癌干细胞凋亡结果51-52
• 5.4 本章小结52-54
• 第六章 结论54-56
• 参考文献56-61
• 硕士期间研究成果61-62
• 致谢62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 冯川;杨先炯;孙警辉;罗庆;宋关斌;;内皮细胞条件培养基对肝癌细胞癌干细胞表型的影响[J];生物医学工程学杂志;2015年05期

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本文编号：969162