IL-23在肝细胞肝癌发展中的作用及机制研究

发布时间：2017-10-07 05:04

  本文关键词：IL-23在肝细胞肝癌发展中的作用及机制研究

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【摘要】：第一部分IL-23表达质粒和稳转细胞系的构建目的:小鼠IL-23融合基因片段的克隆及hepa1-6稳转细胞系的构建。方法:取小鼠hepa1-6细胞提取总RNA,通过RT-PCR克隆p19基因的编码区和p40基因编码区的成熟区;采用重叠延伸PCR的方法,通过编码一段柔性肽段(Gly4Ser)3的DNA序列连接p19片段和p40片段,构建小鼠IL-23单链融合基因,添加酶切位点,并将其克隆至p RRL-Venus慢病毒载体中。通过包装慢病毒感染hepa1-6细胞,再通过流式分选的方法筛得可以稳定表达IL-23的hepa1-6稳转细胞系。结果:DNA测序结果表明:小鼠IL-23融合基因中p19、linker及p40的连接顺序、方向及翻译成氨基酸序列完全正确。结论:成功克隆小鼠IL-23单链融合基因并构建其慢病毒质粒。成功构建可以稳定表达IL-23的hepa1-6稳转细胞系。为进一步研究IL-23在肝细胞肝癌发展中的作用及其机制奠定了基础。第二部分IL-23对肝细胞肝癌细胞系的生物学行为的影响目的:体外检测IL-23对肝细胞肝癌细胞的生物学行为的影响。方法:通过一系列体外实验检测IL-23对肝细胞肝癌细胞的生物学行为的影响。包括:采用MTT实验、Ki-67染色实验检测IL-23对肝细胞肝癌细胞的生长、增殖的影响;通过Annexin V和7AAD的流式染色检测IL-23对肝癌细胞的细胞凋亡的影响;通过细胞周期的流式染色检测IL-23对肝癌细胞的细胞周期的影响;通过划痕实验及transwell实验检测IL-23对肝癌细胞的迁移能力的影响。结果:MTT实验和Ki-67染色结果显示IL-23促进肝癌细胞的增殖;细胞凋亡的染色结果表明IL-23不影响肝癌细胞的细胞凋亡;细胞周期的结果表明IL-23促进肝癌细胞维持在S期和G2期;划痕实验和transwell实验提示IL-23可以促进肝癌细胞的迁移。结论:体外实验揭示IL-23可以促进肝癌细胞的生长、增殖和迁移,并且可以促进肝癌细胞维持在S期和G2期,但是不影响肝癌细胞的细胞凋亡。第三部分IL-23在肝细胞肝癌发展中的作用及机制的研究目的:利用小鼠肝癌动物模型探究IL-23在肝细胞肝癌发展中的作用及其可能的机制。方法:(1)构建肝癌模型:(a.)取对数生长期的hepa1-6稳转细胞用PBS制成单细胞悬液(5×105/ml),每只小鼠注射的细胞量为1×106/2 ml PBS,利用高压水流动力学的注射方法在5-8s内将细胞通过尾静脉注射到小鼠体内。3周后处死小鼠,取出小鼠肝脏,计数肝脏肿瘤结节数;(b.)提前一周给小鼠喝含抗生素(80000U/250ml)的酸性水。取对数生长期的hepa1-6稳转细胞用PBS制成单细胞悬液(4×107/ml),每只小鼠注射的细胞量为1×106/25μl PBS,利用手术的方法,在超净工作台中,将小鼠腹部剖开一小口,挤出肝脏一叶,用胰岛素注射器吸取细胞缓慢的注射入暴露的肝脏中,再将小鼠伤口缝合。2周后处死小鼠,取出小鼠肝脏,测量并计算小鼠肿瘤体积;(c.)取14天大的C57BL/6雄性小鼠,腹腔注射DEN(25mg/kg),于SPF级环境饲养8-10个月,从第5个月开始,每两个月采用高压水流动力学的方法注射对照及IL-23微环质粒,8个月后处死小鼠,计数肝脏肿瘤结节数并测量肿瘤体积。(2)通过流式染色检测荷瘤鼠及HGT注射hepa1-6稳转细胞后1周的非荷瘤鼠脾脏和肝脏中淋巴细胞表面CD3、CD4、CD8、CD62L、CD44、CD25、CD127、CD11b、Gr1等marker的阳性率;胞内染色检测荷瘤鼠及HGT注射hepa1-6稳转细胞后1周的非荷瘤鼠脾脏和肝脏中CD4+T淋巴细胞分泌的IFN-γ、TNF-α和IL-17A以及CD8+T细胞分泌的IFN-γ、TNF-α和IL-17A。利用IL-17A敲基因小鼠重复HGT注射hepa1-6稳转细胞构建肝癌模型的实验确定IL-17A在IL-23介导的促进肝细胞肝癌发展中的作用。采用CBA染色探究IL-23对外周血中细胞因子的影响。结果:通过不同方法构建的肝癌模型表明IL-23在肝细胞肝癌发展中具有促进作用。流式染色结果表明在肝细胞肝癌发展后期IL-23影响了脾脏和肝脏中MDSC、Treg等抑制性细胞的所占的比例及IFN-γ、TNF-α和IL-17A的分泌。在肝细胞肝癌发展早期流式染色结果表示IL-23影响了肝脏中CD4+效应T细胞和CD8+效应T细胞的比例以及脾脏和肝脏中IL-17A的表达水平,其中肝脏中分泌IL-17A的主要细胞是NCR-ILC3细胞。结论:IL-23促进肝细胞肝癌的发展,其可能的机制为IL-23维持了NCR-ILC3细胞IL-17A的分泌进而影响了脾脏和肝脏中MDSC、Treg细胞的比例及T细胞分泌的细胞因子,从而抑制了抗肿瘤免疫反应而促进了肿瘤的发展。
【关键词】：小鼠IL-23 融合基因 重叠延伸PCR 稳转细胞系 MTT实验 Ki-67 细胞凋亡 细胞周期 迁移 肝细胞肝癌 MDSC IL-17A NCR-ILC3
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 前言12-15
• 第一部分IL-23 表达质粒和稳转细胞系的构建15-34
• 1 引言15-16
• 2 材料与方法16-25
• 2.1 实验材料16-18
• 2.2 实验方法18-25
• 3 结果25-32
• 3.1 小鼠IL-23p19、IL-12p40 基因的扩增与克隆25-26
• 3.2 小鼠IL-23 融合基因的克隆26-29
• 3.3 小鼠pRRL-Venus-IL-23 慢病毒质粒的构建29-30
• 3.4 慢病毒颗粒的包装、生产和保存30
• 3.5 稳转细胞系的构建30-32
• 4 讨论32-34
• 第二部分IL-23 对肝细胞肝癌细胞的生物学影响34-46
• 1 引言34-35
• 2 材料与方法35-39
• 2.1 实验材料35-36
• 2.2 实验方法36-39
• 3 结果39-44
• 3.1 IL-23 可以显著地促进肝细胞肝癌细胞的生长39-40
• 3.2 IL-23 不影响肝细胞肝癌细胞的凋亡40-41
• 3.3 IL-23 增加肝细胞肝癌细胞S期和G2 期比例41-42
• 3.4 IL-23 促进hepa1-6 细胞的迁移42-44
• 4 讨论44-46
• 第三部分IL-23 在肝细胞肝癌发展中的作用及机制研究46-70
• 1 引言46-48
• 2 材料与方法48-56
• 2.1 实验材料48-50
• 2.2 实验方法50-56
• 3 结果56-69
• 3.1 IL-23 促进肝细胞肝癌的发展56-58
• 3.2 IL-23 增加MDSC和Treg细胞的比例58-60
• 3.3 IL-23 维持促进IL-17A的分泌并抑制TNF-α 的分泌60-64
• 3.4 肿瘤发生早期IL-23 促进ILC3 细胞分泌IL-17A64-66
• 3.5 IL-17A在IL-23 介导的促进肝细胞肝癌发展过程中起关键作用66-68
• 3.6 IL-23 对血清中细胞因子的影响68-69
• 4 讨论69-70
• 参考文献70-77
• 综述77-86
• 参考文献80-86
• 攻读学位期间公开发表的论文86-87
• 附录87-88
• 致谢88-89

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 Wojciech Blonski;David S Kotlyar;Kimberly A Forde;;Non-viral causes of hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2010年29期

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本文编号：987032