黄芩总黄酮对肺癌EMT的影响及Meta分析Vimentin对NSCLC预后的作用

发布时间：2017-10-09 03:27

  本文关键词：黄芩总黄酮对肺癌EMT的影响及Meta分析Vimentin对NSCLC预后的作用

  更多相关文章： 黄芩总黄酮提取物 非小细胞肺癌 上皮间质转化 顺铂 波形蛋白 非小细胞肺癌 无病生存期 总生存期 Meta分析

【摘要】：肺癌(1ung cancer)是原发性肺癌的简称,其中85%是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)。2008年,全球确诊为肺癌约1.61亿人,为癌症总人数的13%。我国每年肺癌发生增长率为26.9%,若不及时采取相关措施,2025年可能达100万人,其中云南宣威市肺癌标准化死亡千分率为0.83,是全国平均水平的4.11倍。上皮间质转化(epithelial mesenchymal transformation, EMT)指具有细胞极性、细胞间黏附的上皮细胞失去原有特性,转变成迁移和侵袭力较大的间质细胞的过程。EMT与肿瘤转移、耐药及复发之间的关系密切。参与肿瘤EMT的细胞外信号分子有Notch, Hedgehog, TGF-P(Transforming growth factor-β)、RTK (receptor tyrosine kinase)、Wnt等。目前,EMT已成为肿瘤防治研究的热点。大量研究已表明,EMT广泛存在于肺癌之中,并在转移、耐药及肺癌干细胞中起着重要作用。目前,基于天然化合物具有结构丰富、靶点多等特点,已发现诸多天然活性成分及化合物如：中药黄芩和川贝母提取液、南蛇藤乙酸乙酯提取物、蛇床子素、白藜芦醇、毛地黄黄酮等对肿瘤EMT有抑制作用。黄芩以根部入药,是唇形科多年生草本植物。肺癌在中医中属于肺积、咳嗽、咯血、胸痛等范畴,中医治疗肺癌的处方中均利用黄芩的泻肺清热之功效。黄芩对肺癌的药理作用机制包括：诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖、化疗增敏作用、阻止癌细胞转移等。肺癌患者治疗失败主要原因是肿瘤耐药、转移及复发,且均有EMT参与。至今为止,关于黄芩对肺癌EMT是否有影响的研究尚未见报道。本课题拟研究黄芩总黄酮提取物对TGF-β1诱导肺癌A549细胞发生EMT的影响。首先,通过TGF-β1诱导A549细胞发生EMT,然后黄芩总黄酮提取物对其进行干预；采用MTT法、划痕实验、Transwell小室和PT-PCR实验对其进行研究；同时,研究黄芩总黄酮提取物对肺癌A549细胞因EMT而可能产生顺铂耐药、迁移和侵袭的影响。本研究结果：黄芩总黄酮提取物作用于TGF-p1诱导组和未诱导组中的肺癌A549细胞72h后的IC50值分别是48.790ug/ml和43.178ug/ml(P=0.0393),在黄芩总黄酮提取物浓度为50ug/mL时,两组细胞增殖抑制率存在显著差异,但在其他浓度均无显著差异(P0.05)；顺铂对TGF-p1未诱导组、诱导组及诱导组联合50ug/ml黄芩总黄酮提取物的肺癌A549细胞作用48h的IC50值分别是2.993ug/ml、3.314ug/ml 和 2.434ug/ml (P=0.0025),联合诱导组相对于未诱导组和诱导组的顺铂IC50值具有显著性差异(P0.05),且分别降低18.68%和26.55%;虽然诱导组和未诱导组之间的IC50并未存在显著差异(P0.05),但不管肺癌A549细胞是否发生EMT,黄芩总黄酮提取物在顺铂浓度2～4ug/ml内都增加其对顺铂的敏感性,奇怪的是在0～1ug/ml 和 6～8ug/ml内起着相反的作用。不论TGF-β1诱导组还是未诱导组的肺癌A549细胞,黄芩总黄酮提取物对其均有抑制细胞迁移、侵袭的作用,呈浓度依赖性,且两组的细胞迁移和侵袭抑制率差异无统计学意义(P0.05)。黄芩总黄酮提取物可逆转TGF-β1诱导下调上皮细胞标记蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)和上调间质细胞标记蛋白波形蛋白(Vimentin) mRNA表达,呈浓度依赖性。综上所述,黄芩总黄酮提取物对TGF-β1诱导肺癌549细胞发生EMT有一定的抑制作用,这可能与上调E-cadherin和下调Vimentin mRNA表达有关。此外,不管肺癌549细胞是否发生EMT,黄芩总黄酮提取物均抑制其细胞迁移、侵袭,并呈浓度依赖性,且在顺铂浓度2～4ug/ml内增加其对顺铂敏感性。病理TNM(tumor node metastasis)分类、年龄、性别及肿瘤类型均是影响非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者预后的重要因素,上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)参与肿瘤形成、侵袭、转移、复发及耐药过程,其关键生物调控因子可为临床预后提供重要的生物标记分子。EMT过程中上皮细胞标记蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)低表达不利于NSCLC患者总生存期(overall survival, OS),且与肿瘤分化、淋巴转移、血管侵袭及TNM分期有关。波形蛋白(Vimentin)是间质细胞标记蛋白,近年随着关于Vimentin表达对NSCLC患者预后影响的研究逐渐增多,其研究结果仍存在一定差异。至今为止,国内外尚无关于Vimentin表达对NSCLC患者预后的影响进行Meta分析。因此,本研究采用Cochrane系统评价方法,Meta分析免疫组化检测NSCLC患者肿瘤组织Vimentin表达水平对NSCLC患者OS和无病生存期(disease-free survival, DFS)的影响,以期为其临床应用提供相关证据。从CNKI、Wang Fang、 VIP、CMB、EMBASE、MEDLINE、PUBMED、The Cochrane library、The clinical trail、Elsevier SD外文期刊数据库、SCI科学引文索引数据库中查找Vimentin表达与NSCLC患者预后相关的前瞻性队列研究,文献检索时限均从建库至2015年2月2日。由两位研究者对检索踢重后得到的研究根据纳入和排除标准,独立筛选文献、提取材料和评估质量,并交叉核查后,采用Stata12.0软件对结果进行Meta分析。本研究共纳入9篇文献,有9项研究(n=1 302)。Meta分析Vimentin表达对N SCLC患者OS和DFS影响的合并风险比(hazard ratio, HR)分别为HR=2.04,95%CI(1.57,2.66), P0.001 和 HR=1.56,95%CI(1.20-2.04), P=0.001;采用Begg、Egger检验分析OS时纳入9个研究的结果表明：无统计学发表偏倚；且敏感性分析结果表明：本次分析结果较稳定。总之,Vimentin高表达是NSCLC患者OS和DFS的不利风险因素,但由于本次meeta分析纳入的研究数量较少,其结论有待大样本量的研究进行证实。
【关键词】：黄芩总黄酮提取物 非小细胞肺癌 上皮间质转化 顺铂 波形蛋白 非小细胞肺癌 无病生存期 总生存期 Meta分析
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 摘要6-9
• Abstract9-22
• 缩略词22-23
• 黄芩总黄酮提取物对TGF-β_1诱导肺癌A549细胞上皮间质转化的影响23-91
• 第一章 绪论24-38
• 1.1 非小细胞肺癌与上皮间质转化24-30
• 1.1.1 肺癌流行病学24
• 1.1.2 上皮间质转化定义及分类24-25
• 1.1.3 上皮间质转化分子调控机制25-26
• 1.1.4 肺癌中上皮间质转化现象26-27
• 1.1.5 上皮间质转化与肺癌转移27-28
• 1.1.6 上皮间质转化与肺癌耐药28-29
• 1.1.6.1 上皮间质转化与化疗药物耐药28
• 1.1.6.2 上皮间质转化与分子靶向药物耐药28-29
• 1.1.7 上皮间质转化与肺癌干细胞29-30
• 1.2 上皮间质转化中潜在抗肿瘤作用靶点30-32
• 1.3 天然化合物与肿瘤上皮间质转化32-34
• 1.4 黄芩与肺癌34-35
• 1.5 本课题研究的内容、目的意义及技术路线35-38
• 1.5.1 研究内容35-36
• 1.5.2 研究的目的意义36-37
• 1.5.3 技术路线37-38
• 第二章 材料与方法38-60
• 2.1 材料38-41
• 2.1.1 供试样品38
• 2.1.2 化学药品和试剂38-39
• 2.1.3 主要仪器与耗材39-40
• 2.1.4 主要试剂配制40-41
• 2.2 黄芩总黄酮提取物样品制备41-44
• 2.2.1 黄芩总黄酮提取物提取方案41-42
• 2.2.2 黄芩总黄酮提取物提取技术路线图42
• 2.2.3 黄芩总黄酮提取物鉴定42-43
• 2.2.3.1 金属盐类试剂的络合反应42-43
• 2.2.3.2 碱性试剂显色反应43
• 2.2.4 黄芩总黄酮提取物工作液配制43-44
• 2.2.4.1 配药过程43-44
• 2.3 黄芩总黄酮提取物对TGF-β_1诱导A549发生EMT的影响44-58
• 2.3.1 A549细胞培养44-45
• 2.3.1.1 细胞株的冻存44
• 2.3.1.2 冻存细胞株的复苏44-45
• 2.3.1.3 细胞株的传代45
• 2.3.2 摸索TGF-β_1诱导A549细胞发生EMT的时间45-46
• 2.3.3 MTT法46-48
• 2.3.3.1 MTT实验原理46
• 2.3.3.2 MTT法检测不同浓度黄芩总黄酮提取物对肺癌A549细胞作用72h的细胞增殖抑制率46
• 2.3.3.3 MTT法检测不同浓度黄芩总黄酮提取物对TGF-β_1诱导肺癌A549细胞作用48h的细胞增殖抑制率46-47
• 2.3.3.4 MTT法检测不同浓度顺铂对肺癌A549细胞作用48h的细胞增殖抑制率47
• 2.3.3.5 MTT法检测不同浓度顺铂对TGF-β_1诱导肺癌A549细胞作用48h的细胞增殖抑制率47-48
• 2.3.3.6 MTT法检测50ug/ml黄芩总黄酮提取物联合不同浓度顺铂对TGF-β_1诱导肺癌A549细胞作用48h的细胞增殖抑制率48
• 2.3.4 划痕实验48-49
• 2.3.4.1 实验原理48
• 2.3.4.2 细胞划痕实验研究不同浓度黄芩总黄酮提取物对肺癌A549细胞作用48h的细胞迁移抑制率48-49
• 2.3.4.3 细胞划痕实验研究不同浓度黄芩总黄酮提取物对TGF-β_1诱导肺癌A549细胞作用48h的细胞迁移抑制率49
• 2.3.5 Transwell小室实验49-52
• 2.3.5.1 Transwell小室侵袭实验原理49-50
• 2.3.5.2 预实验方案及优化条件50-51
• 2.3.5.3 黄芩总黄酮提取物对肺癌A549细胞作用48h不同浓度的细胞侵袭抑制率51
• 2.3.5.4 黄芩总黄酮提取物对TGF-β_1诱导A549细胞发生EMT作用48h不同浓度的细胞侵袭抑制率51-52
• 2.3.6 RT-PCR52-58
• 2.3.6.1 实验原理52
• 2.3.6.2 采用Primer Premier 5.0结合oligo6.0软件设计引物52-53
• 2.3.6.3 细胞不同处理53-54
• 2.3.6.4 细胞总RNA提取54
• 2.3.6.5 细胞总RNA质量评价54
• 2.3.6.6 配制1.3%RNA电泳琼脂糖凝胶54-55
• 2.3.6.7 RNA电泳55
• 2.3.6.8 1st strandcDNA合成反应55-56
• 2.3.6.9 目标片段PCR扩增Tm摸索56-57
• 2.3.6.10 目标片段PCR扩增57-58
• 2.3.6.11 配制1.3% DNA电泳琼脂糖凝胶58
• 2.3.6.12 DNA电泳58
• 2.4 数据统计分析58-60
• 2.4.1 IC_(50)值58-59
• 2.4.1.1 IC_(50)计算方法58-59
• 2.4.2 细胞增殖抑制率59
• 2.4.3 细胞迁移抑制率59
• 2.4.4 细胞侵袭抑制率59-60
• 第三章 结果60-75
• 3.1 黄芩总黄酮提取物提取及鉴别结果60
• 3.2 TGF-β_1诱导A549细胞发生EMT的时间结果60-61
• 3.3 MTT实验结果61-66
• 3.3.1 不同浓度黄芩总黄酮提取物对TGF-β_1诱导组、未诱导组A549细胞作用72h的细胞增殖抑制率结果61-63
• 3.3.2 不同浓度顺铂对TGF-β_1未诱导组、TGF-β_1诱导组以及TGF-β_1诱导组联合50ug/ml黄芩总黄酮提取物肺癌A549细胞作用48h的细胞增殖抑制率结果63-66
• 3.4 细胞划痕实验结果66-68
• 3.4.1 不同浓度黄芩总黄酮提取物对TGF-β_1诱导组、未诱导组A549细胞作用48h的细胞迁移抑制率结果66-68
• 3.5 Transwell小室实验结果68-70
• 3.5.1 不同浓度黄芩总黄酮提取物对TGF-β_1诱导组、未诱导组A549细胞作用48h的细胞侵袭抑制率结果68-70
• 3.6 RT-PCR实验结果70-75
• 3.6.1 总RNA电泳检测结果70
• 3.6.2 总RNA浓度检测结果70-71
• 3.6.3 不同浓度黄芩总黄酮提取物对TGF-β_1诱导组、未诱导组A549细胞作用48h的上皮细胞标记蛋白E-cadherin、间质细胞标记蛋白Vimentin的mRNA表达结果71-75
• 第四章 讨论与总结75-77
• 4.1 讨论75-76
• 4.2 总结76-77
• 参考文献77-91
• Meta分析Vimentin表达对NSCLC患者预后的影响91-114
• 第一章 绪论92-93
• 1.1 Meta分析背景与目的92-93
• 第二章 材料与方法93-101
• 2.1 文献检索93-98
• 2.1.1 CNKI检索策略93
• 2.1.2 Wang Fang检索策略93
• 2.1.3 VIP检索策略93-94
• 2.1.4 CMB检索策略94
• 2.1.5 EMBASE和MEDLINE检索策略94-95
• 2.1.6 PUBMED检索策略95-97
• 2.1.7 Elsevier SD外文期刊数据库检索策略97
• 2.1.8 SCI科学引文索引数据库检索策略97
• 2.1.9 The Cochrane library检索策略97
• 2.1.10 The clinical trail检索策略97-98
• 2.2 文献纳入排除标准98
• 2.2.1 纳入标准98
• 2.2.2 排除标准98
• 2.3 资料提取与文献质量评价98-100
• 2.4 统计学方法100-101
• 第三章 结果101-109
• 3.1 文献纳入101
• 3.2 纳入文献基本特征101-103
• 3.3 文献质量评价103
• 3.4 Vimentin表达对NSCLC患者预后影响的meta分析结果103-106
• 3.4.1 对NSCLC患者OS的影响103-105
• 3.4.2 对NSCLC患者DFS的影响105-106
• 3.5 发表偏倚106-108
• 3.6 敏感性分析108-109
• 第四章 讨论与总结109-111
• 参考文献111-114
• 致谢114-115
• 附录A 攻读硕士期间发表论文目录115-116
• 附录B 其他需要说明的内容116

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

1 张春云;谢伟刚;张雅丽;吴冬青;任雪峰;杨自嵘;;黄芩总黄酮的含量测定及提取工艺优化[J];光谱实验室;2011年03期

2 宋英华;张才擎;曹智新;徐嘉雯;王令成;林晓燕;;肺鳞癌肿瘤浸润前沿细胞的EMT表型特点及临床意义[J];中国肺癌杂志;2014年04期

3 王英妹;郑海峰;武铁军;李庆祥;张健;;黄芩苷干预肺腺癌细胞前后肿瘤细胞侵袭能力的变化[J];河北医药;2012年09期

4 曲丹;李钰;徐小Z，

本文编号：997925