基于网络药理学技术探讨益气活血方治疗心肌缺血的分子机制研究

发布时间：2017-10-24 02:15

  本文关键词：基于网络药理学技术探讨益气活血方治疗心肌缺血的分子机制研究

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【摘要】：目的：通过网络药理学技术对益气活血方中黄芪、当归、人参、三七、川芎5味中药进行研究,探讨益气活血方治疗心肌缺血的靶点和有效成分,从而进一步阐明其药效物质基础,并建立药物成分-靶蛋白-疾病网络；通过复制急性心肌缺血动物模型,加以益气活血方进行药物干预,探讨益气活血方对心肌缺血大鼠梗死边缘区心肌组织中的钠氢交换体-1(NHE-1)、钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ(CaMK Ⅱ)、血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)和缺氧诱导因子-α (HIF-la)等相关基因和蛋白的表达的影响。方法：1.通过TCMD2009数据库检索,整理去除重复数据后,获得益气活血方中的有效化学成分。通过TTD数据库调研收集与心肌缺血疾病相关的靶蛋白后,从PDB数据库中下载所有蛋白质靶标结构。2.益气活血方中药成分与靶蛋白的分子对接及网络分析：采用Accelrys Discovery Studio软件对中药成分和靶蛋白进行分子构建和分子对接。通过Cytoscape2.8.1软件,构建小分子化学成分-靶蛋白系统网络。运用plugins面板下的network analysis计算网络参数：节点数目(number of nodes)、网络度(network density、网络异质性(network heterogeneity)、平均相邻节点数(average number of neighbors)、特征路径长度(characteristic path length)、最短路径(shortest paths)、网络中心度(network centralization)等,并对这些网络参数进行分析。综上,通过建立的中药分子一靶标蛋白的疾病网络,预测益气活血方药中治疗心肌缺血疾病的活性成分,从而完善益气活血方作用的物质基础。3.复制急性心肌缺血模型后,利用超声心动仪器检测7天组、28天组各组大鼠左心室质量、左心室容积、左心室内径、左心室射血分数以及左心室短轴缩短率等左心功能指标；通过HE病理染色结果观察大鼠梗死边缘区心肌组织结构,以综合评价心肌缺血动物模型制作的成功以及益气活血方对心肌缺血大鼠心肌病理组织的影响。采用RT-PCR方法,检测7天组、28天组梗死边缘区心肌组织中VEGFR-2、HIF-1α、CaMKⅡ、NHE-1基因层面表达的变化情况。采用蛋白免疫印迹(Western blotting, WB)方法检测VEGFR-2和HIF-1α蛋白在梗死边缘区心肌组织中的表达情况,结果：1.网络药理学分析结果：分析已建立的益气活血方中药分子一靶标蛋白的疾病网络,当预设网络度为大于8时,VEGFR-2、NHE-1、CaMKⅡ、PKC这4个靶蛋白与益气活血方药小分子存在较强的作用联系,推测益气活血方能够通过其中有效成分的协同作用来发挥治疗心肌缺血疾病的作用效果。2.测定各组大鼠左心功能的结果：7天、28天的模型组与假手术组相比,模型组大鼠左心室射血分数(EF%)、左心室短轴率(FS%)明显降低,左心室质量(LVW)、左心室舒张末期内径(LVIDd)、收缩末期内径(LVIDs)、左心室舒张末期容积(EDV)与收缩末期容积(ESV)明显增大,有显著性差异(P0.01)；药物干预后,7天各给药组与模型组相比无明显差异,28天各给药组与模型组比较,EF%、FS%均升高,LVIDd和LVIDs、LVW、EDV、ESV均降低,且差异有统计学意义(P0.05)。HE病理染色结果显示,7天、28天的模型组大鼠边缘区心肌细胞排列紊乱,纹理走向不确定,部分可见灶性心肌纤维走形中断,大量炎性细胞浸润,心肌纤维着色不均且颗粒样变性；28天各给药组与模型组相比,可见心肌细胞少量排列紊乱,胞浆纹理出现少数不规则横带,少量炎性细胞浸润。3.分子生物学指标结果：7天的模型组与假手术组相比,模型组大鼠梗死边缘区心肌组织中NHE-1 mRNA、CaMKⅡ mRNA、HIF-1amRNA和蛋白的表达升高(P0.05),VEGFR-2 mRNA和蛋白的表达无明显变化；28天模型组与假手术组相比,模型组大鼠梗死边缘区组织中NHE-1 mRNA、CaMKⅡ mRNA, HIF-lamRNA和蛋白、VEGFR-2 mRNA和蛋白的表达均升高显著(P0.01)。药物干预后,7天各给药组与模型组相比,各给药组的大鼠梗死边缘区心肌组织中NHE-1 mRNA、CaMKII mRNA的表达明显降低(P0.01), VEGFR-2和HIF-1α的基因和蛋白表达量均升高,且具有显著性差异(P0.01)；28天各给药组与模型组相比,各给药组的大鼠梗死边缘区心肌组织中NHE-1mRNA, CaMKII mRNA、HIF-1αmRNA和蛋白、VEGFR-2 mRNA的基因和蛋白表达量的表达均降低,差异具有统计学意义。结论：1.网络药理学技术通过预测和分析益气活血方中药成分,有助于分析益气活血方中的有效成分及其治疗心肌缺血疾病的相关靶点。2.益气活血方可以改善梗死边缘区心肌组织血液的供应,以达到改善心肌缺血大鼠的左心功能和心脏结构的效果；缺血缺氧情况下,机体进行代偿性的钠氢交换反应,而益气活血方可以通过调控NHE-1、CaMKII基因的表达,抑制梗死边缘区心肌组织细胞中钙离子超载,改善心肌组织的血管舒张能力、增加心肌血流量,进而有可能改善心肌缺血症状；同时通过研究发现益气活血方可以促进VEGFR-2和HIF-1α的基因和蛋白的表达,推测益气活血方可能可以促进心肌缺血大鼠的血管新生与成熟,使缺血心肌组织的血液供应得以改善,从而减缓心肌缺血向不良病程的方向发展。创新点：1.本研究通过将网络药理学技术和动物实验相结合,从网络药理角度阐释中药作用的理论,在分子水平上认识益气活血方治疗心肌缺血疾病的作用机制,同时为益气活血方多组分、多靶点、多途径的药效机制提供了科学依据。2.本研究明确了益气活血方可以促进心肌缺血大鼠心肌组织中血管的新生和成熟,同时可以通过钙调蛋白激酶信号通路调节CaMKⅡ和NHE-1的基因表达,进一步对缺血心肌细胞进行保护作用,从而改善缺血心肌组织引起的心脏功能障碍,
【关键词】：网络药理学 网络分析 心肌缺血 益气活血方
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R259
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-12
• 符号说明12-14
• 第一部分 文献综述14-31
• 综述一 网络药理学技术在中医药领域研究概况14-18
• 1 网络药理学技术基础14-16
• 2 网络药理学在中医药领域中的探索16
• 3 展望16-18
• 综述二 心肌缺血疾病药物治疗的理论基础18-25
• 1 现代医学对心肌缺血的药物治疗18-21
• 2 中医药治疗心肌缺血疾病的理论基础21-24
• 3 展望24-25
• 参考文献25-31
• 第二部分 实验研究31-75
• 前言31-32
• 研究一 益气活血方分子作用于心肌缺血疾病靶点的网络药理学研究32-39
• 1 材料32
• 2 方法32-33
• 3 结果33-37
• 4 小结37-38
• 5 讨论38-39
• 研究二 动物实验研究39-75
• 实验一 益气活血方对心肌缺血大鼠左心功能的影响和评价39-53
• 1 材料39-40
• 2 方法40-43
• 3 结果43-51
• 4 小结51-52
• 5 讨论52-53
• 实验二 益气活血方对心肌缺血大鼠边缘区心肌组织中NHE-1和CaMKⅡ基因表达的影响53-62
• 1 材料53-54
• 2 方法54-56
• 3 结果56-59
• 4 小结59
• 5 讨论59-62
• 实验三 益气活血方对心肌缺血大鼠边缘区心肌组织中VEGFR-2和HIF-1α的基因和蛋白表达的影响62-75
• 1 材料62-64
• 2 方法64-65
• 3 结果65-72
• 4 小结72
• 5 讨论72-75
• 结语75-76
• 参考文献76-80
• 致谢80-81
• 个人简历81-83
• 附图83-90
• 附图一 各组大鼠心电图83-88
• 附图二 各组大鼠各时间节点梗死边缘区的病理状态(10×40倍)88-90
• 附图三 各组大鼠超声心动图90

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本文编号：1086551