铁皮石斛中抗肿瘤活性物质的分离纯化

发布时间：2016-09-16 13:20

  本文关键词：铁皮石斛中抗肿瘤活性物质的分离纯化，由笔耕文化传播整理发布。

《华南理工大学》 2014年

铁皮石斛中抗肿瘤活性物质的分离纯化

郑秋平  

【摘要】：本文采用两条研究路线对铁皮石斛中的抗肿瘤活性物质进行了分离纯化：1.采用乙酸乙酯、95%乙醇和水三种不同极性的溶剂依次对铁皮石斛茎的干燥粉末进行了提取，初步得到了三种提取物；初提取物在MTT细胞增殖检测结果的指引下，结合硅胶柱层析、TLC薄层分析和凝胶柱层析进行分离纯化，最终筛选出具有强抗肿瘤活性的组分，并结合质谱、核磁（氢谱）及相关文献对该化合物的结构进行了鉴定。2.用硫酸铵沉淀法从铁皮石斛的PBS提取液中制备出粗蛋白，再用碱性蛋白酶Alcalase2.4L、胰蛋白酶和碱性蛋白酶37017三种酶在各自给定的酶解条件下对铁皮石斛粗蛋白进行酶解，酶解产物经Sephedax G-25柱层析分成不同分子量的组份，随后用MTT法筛选出抗肿瘤活性较好的组份，最后利用质谱技术对筛选出的组分中多肽的序列进行鉴定，并合成之。本研究的主要成果如下： 1)乙酸乙酯提取物经分离纯化后得到强抗肿瘤活性物质TD1和TD2，TD1对肝癌细胞HepG-2、胃癌细胞SGC-7901和乳腺癌细胞MCF-7的半抑制浓度IC50分别为：0.45μg/mL、0.36μg/mL、0.34μg/mL，抗肿瘤作用要明显强于TD2和阳性对照。随后结合质谱、核磁（氢谱）及相关文献比对TD1和TD2的化学结构进行鉴定，其结果为：TD1为金叉石斛菲醌(denbinobin)，该化合物是铁皮石斛中重要的抗肿瘤物质，其抗肿瘤活性已得到广泛的研究和认可，有望成为新的抗肿瘤药物。TD2为柚皮素(Naringenin)，该化合物是一种广谱抗肿瘤化合物，不仅可以直接抑制肿瘤细胞的增殖，还可以增强其它抗肿瘤药物的效果，有重要的研究价值。但是在研究TD1和TD2对正常肝细胞L-O2的细胞毒性的实验中发现，TD1和TD2对L-O2的IC50分别是：2.12μg/mL和8.34μg/mL，由此可见它们在杀死癌细胞的同时也会损害正常细胞，因此要想开发以TD1和TD2为原料的抗肿瘤药物还有很长的路要走。 2)铁皮石斛粗蛋白的碱性蛋白酶Alcalase2.4L酶解产物经Sephedax G-25纯化后得到的A3组份，不仅分子量较低，而且多肽含量高，达到99.2%，还对胃癌细胞SGC-7901有明显的抑制作用，因此选择A3进行下一步研究。研究发现A3对肝癌细胞HepG-2、胃癌细胞SGC-7901和乳腺癌细胞MCF-7都有一定的抑制作用，半抑制浓度IC50分别为：169.62μg/mL、155.20μg/mL、107.53μg/mL，A3对MCF-7的抑制效果要明显好于其它两种癌细胞，且在浓度为1000μg/mL时对正常肝细胞L-O2的增殖没有抑制作用。 3)对A3一级质谱数据进行分析后决定对占峰面积百分比较大的三个多肽(荷质比分别为：1417.840、2994.743和1504.81)进行测序和合成。测序结果(C→N)： P1(RHPFDGPLLPPGD)、P2(KPEEVGGAGDRWTC)和P3(RCGVNAFLPKSYLVHFGWKLLFHFD)。合成这三个多肽之后，利用HPLC和MS对它们的纯度和分子量进行了检测，合成肽的纯度均在98%以上，分子量理论分子量的差距均在0.1%以内。 4)利用MTT法检测合成肽的抗肿瘤活性后发现：合成肽对肝癌细胞HepG-2、胃癌细胞SGC-7901和乳腺癌细胞MCF-7都没有表现出明显的抗肿瘤活性，这与A3的抗肿瘤活性相差甚远，同时合成多肽对正常肝细胞L-O2也没有表现出明显的抑制作用。据分析这些差异可能是由于多肽的空间结构改变，合成的多肽不稳定等原因造成的，具体情况有待进一步研究。

【关键词】：
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R284.2
【目录】：

下载全文 更多同类文献

CAJ全文下载

(如何获取全文？ 欢迎：购买知网充值卡、在线充值、在线咨询)

CAJViewer阅读器支持CAJ、PDF文件格式

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 吕爱新;于宏伟;赵志强;杨青;苗瑞;李娜;张芳;;柚皮素研究进展[J];安徽农业科学;2011年13期

2 廖忠莉;汤旭东;王国珍;周媛;杨武晨;周圆圆;覃勇;胡建;郭红;;人端粒酶逆转录酶表位多抗原肽疫苗的体外抗肿瘤免疫效应研究[J];第三军医大学学报;2012年11期

3 魏小勇;龙艳;;金钗石斛生物碱对糖性白内障大鼠诱导型一氧化氮合酶基因的调控[J];解剖学研究;2008年03期

4 钟山;尹玉华;杨得坡;;RP-HPLC法测定中药材蚂蟥中蚂蟥多肽的含量[J];分析试验室;2013年11期

5 李瑞芳;左学兰;周颖;何莉;陈飞;;柚皮素对人髓系白血病K562细胞增殖的作用[J];武汉大学学报(医学版);2007年03期

6 张乃霞,吴宫,王跃丰,王中华,冯传莉,吴厚铭;马氏钳蝎蝎毒短肽BmK622的分离纯化和一级结构测定[J];化学学报;2003年04期

7 陈云龙,何国庆,张铭,李慧君;细茎石斛多糖的降血糖活性作用[J];浙江大学学报(理学版);2003年06期

8 王中胜;朱云平;贺福初;;肽序列从头测序算法[J];军事医学科学院院刊;2006年05期

9 李娟;李顺祥;黄丹;赵兴兵;蔡光先;;铁皮石斛资源、化学成分及药理作用研究进展[J];科技导报;2011年18期

10 范建;刘绪;范春芬;黄江锋;罗兵;彭良才;夏涛;;棉花纤维素生物合成相关蛋白的抗体制备[J];棉花学报;2012年02期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 李燕;铁皮石斛化学成分的研究[D];中国协和医科大学;2009年

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 任羽;尹俊梅;;我国热带兰育种存在的问题及对策[J];安徽农学通报;2007年06期

2 袁晓红;马全;李克秀;;昆嵛山血管紧张素转换酶抑制剂原料植物资源调查[J];安徽农业科学;2009年11期

3 吴继卫;;海洋来源生物活性肽的抗肿瘤作用研究进展[J];安徽农业科学;2009年21期

4 范益军;何兴金;何涛;淳泽;;正交设计优选金钗石斛多糖提取工艺研究[J];安徽农业科学;2009年23期

5 魏明;杨超英;;磷限制培养中霍山石斛类原球茎增殖和多糖合成的动力学研究[J];安徽农业科学;2009年24期

6 朱国富;朱克花;陈剑兵;阮关海;陈合云;郑学强;;菜籽生物活性肽的研究进展[J];安徽农业科学;2009年28期

7 卢文芸;张宇斌;罗迎春;何可群;李洪庆;乙引;;不同培养条件对环草石斛愈伤组织中次生代谢产物的影响[J];安徽农业科学;2009年33期

8 韩晓红;段春红;阎贺静;朱雪云;白松;;铁皮石斛原球茎液体悬浮培养研究进展[J];安徽农业科学;2010年20期

9 卢文芸;何可群;姜细艳;次曲珍;廖建华;;不同产地的石斛中总生物碱和多糖含量与其价格关系的探讨[J];安徽农业科学;2010年24期

10 蒙爱东;闫志刚;梁定仁;胡东南;;不同种植月龄铁皮石斛试管苗生长及活性成分含量比较[J];安徽农业科学;2010年28期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 邹瑶;齐桂年;王绍梅;;应用二次回归正交旋转组合设计优化茉莉花渣多糖提取工艺[A];经济发展方式转变与自主创新——第十二届中国科学技术协会年会（第二卷）[C];2010年

2 任羽;杨光穗;尹俊梅;;石斛种质资源遗传多样性的SRAP分析[A];2007年中国园艺学会观赏园艺专业委员会年会论文集[C];2007年

3 徐静;于红霞;;牡蛎提取物的保健作用研究进展[A];山东营养学会营养与疾病学术研讨会论文汇编[C];2006年

4 赖荣才;;石斛药理研究进展[A];畜牧业环境、生态、安全生产与管理——2010年家畜环境与生态学术研讨会论文集[C];2010年

5 顾慧芬;庄意丽;梅其春;;基于ITS序列分析铁皮石斛试管苗的亲缘关系[A];2008年中国药学会学术年会暨第八届中国药师周论文集[C];2008年

6 邹瑶;齐桂年;;茉莉花渣多糖降血糖、改善糖尿病症状作用的研究[A];中国茶叶科技创新与产业发展学术研讨会论文集[C];2009年

7 李维林;亢海芸;傅晖;夏冰;;糖尿病治疗中常用的中草药[A];药用植物研究与中药现代化——第四届全国药用植物学与植物药学术研讨会论文集[C];2004年

8 于瑞丽;;石斛属植物的药理作用研究概况[A];2009浙江省中药学术年会论文集[C];2009年

9 王芬;何华亮;刘铜华;;单味中药治疗糖尿病作用机制的研究进展[A];第九次全国中医糖尿病学术大会论文汇编[C];2006年

10 王芬;何华亮;刘铜华;;单味中药治疗糖尿病作用机制的研究进展[A];中华中医药学会内科分会消渴病第五届学术研讨会论文集[C];2006年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 龚志华;茯苓辐照降解及其产物生物活性研究[D];湖南农业大学;2010年

2 王军辉;金钗石斛多糖的化学结构与抗白内障活性研究[D];合肥工业大学;2011年

3 张清丽;酪蛋白活性肽对乳酸菌生长代谢及酸乳发酵影响的研究[D];华南理工大学;2011年

4 贾韶千;银杏抗氧化肽的制备、结构鉴定及活性研究[D];南京林业大学;2011年

5 龚吉军;油茶粕多肽的制备及其生物活性研究[D];中南林业科技大学;2011年

6 董玉莲;一种海产小杂鱼酶解物生理活性组分的分离纯化与表征[D];中国科学院研究生院（广州地球化学研究所）;2002年

7 陈云龙;细茎石斛多糖的一级结构表征及生物活性[D];浙江大学;2003年

8 刘伟;石斛类原球茎体增殖及ABA对其耐脱水性的诱导[D];华南师范大学;2002年

9 祝雯;河蚬（Corbicula fluminea）活性糖蛋白和多糖的分离纯化及其抗病特性[D];福建农林大学;2004年

10 薛照辉;菜籽肽的制备及其生物活性的研究[D];华中农业大学;2004年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 葛静微;猪血中超氧化物歧化酶（SOD）和血红素的提取及SOD的应用研究[D];华中农业大学;2010年

2 王俊;林荫银莲花离体快繁体系的优化及其有效成分的研究[D];华中农业大学;2010年

3 王姗;三种石杉属植物显微形态及石杉碱甲分析研究[D];华中农业大学;2010年

4 刘纯友;大米蛋白的提取与改性研究[D];长沙理工大学;2009年

5 诸燕;铁皮石斛种质资源收集与评价[D];浙江农林大学;2010年

6 王丹丹;菜籽蛋白及其酶水解物的制取方法改进研究[D];南京财经大学;2010年

7 胡刚;酶解猪血球蛋白的制备及饲喂效果的研究[D];武汉工业学院;2010年

8 唐婧苗;鸭肉低聚肽的制备与性质研究[D];武汉工业学院;2010年

9 王静;海参多肽的酶法制备及体外抗氧化性能研究[D];烟台大学;2010年

10 史云丽;酶法制备大米抗氧化活性肽的研究[D];中南林业科技大学;2009年

【二级参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 谢辉;李莉;吴鸣谦;陈双林;;1株杜仲内生真菌的抗氧化活性分析和菌种鉴定[J];安徽农业科学;2009年01期

2 于力文,蔡永萍,张鹤英,吴庆生;安徽霍山3种石斛营养成分分析及其分布规律[J];安徽农业科学;1996年04期

3 李荣,李俊;黄酮类化合物药理活性及其构效关系研究进展[J];安徽医药;2005年07期

4 罗慧玲,蔡体育,陈巧伦,梅承恩,李永强,黄民权;石斛多糖增强脐带血和肿瘤病人外周血LAK细胞体外杀伤作用的研究[J];癌症;2000年12期

5 张华山;猪血蛋白的酶水解及氨基酸含量[J];氨基酸和生物资源;1999年03期

6 侯奎;刘玉军;陆荣;刘小娟;周芸;樊美珍;;葛内生真菌次生代谢产物清除自由基活性的研究[J];安徽农业大学学报;2008年02期

7 丁亚平，杨道麒，吴庆生，于力文，徐云;安徽霍山三种石斛总生物碱的测定及其分布规律研究[J];安徽农业大学学报;1994年04期

8 陈照荣,来平凡,林巧;不同炮制方法对石斛中石斛碱和多糖溶出率的影响[J];浙江中医学院学报;2002年04期

9 李岩，马秀俐，，曲绍春，王黎，杜柏榕，朱伟;西洋参根粗多糖对免疫功能低下小鼠免疫功能的影响[J];白求恩医科大学学报;1996年02期

10 李江滨,黄迪南;贻贝的药用价值研究进展[J];水产科学;2004年11期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 李燕;铁皮石斛化学成分的研究[D];中国协和医科大学;2009年

中国硕士学位论文全文数据库 前3条

1 张辉;太平洋牡蛎（Crassostrea gigas Thunberg）中氨基酸和寡肽的提取及活性初步研究[D];中国海洋大学;2005年

2 魏鹏;构建铁皮石斛多维指纹图谱方法的研究[D];合肥工业大学;2007年

3 宋紫辉;柚皮素对急性免疫性肝损伤的保护作用[D];河南大学;2009年

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 李玲;邓晓兰;赵兴兵;曾勇;欧阳冬生;;铁皮石斛化学成分及药理作用研究进展[J];肿瘤药学;2011年02期

2 泮玉华;王文霞;章乐建;;乐清栽培的铁皮石斛其有效部位化学成分的动态研究[J];海峡药学;2011年10期

3 高秀娟;王春生;;鲜品铁皮石斛的应用介绍[J];北京中医药;2013年07期

4 张岗;张大为;赵明明;郭顺星;;铁皮石斛分子生物学研究进展[J];中国药学杂志;2013年19期

5 陈丽娟;铁皮石斛[J];中药通报;1957年01期

6 杨俭;;新鲜的铁皮石斛将净化铁皮石斛市场,实实在在地为百姓谋福[J];养生月刊;2006年04期

7 袁正仿,张卫明,丁小余,张苏锋;铁皮石斛的栽培研究[J];中国医学生物技术应用;2002年04期

8 张泉锋,毛碧增;铁皮石斛培养的产业化研究[J];中草药;2004年04期

9 魏小勇,张铭;铁皮石斛与绞股蓝原生质体融合的初步研究[J];中草药;2004年07期

10 范俊安,王继生,张艳,任凌燕,邱宗荫,夏永鹏;铁皮石斛组培品与野生品的形态组织学和多糖含量比较研究[J];中国中药杂志;2005年21期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 诸燕;斯金平;张爱莲;;人工栽培铁皮石斛多糖质量分数研究[A];第八届全国药用植物及植物药学术研讨会论文集[C];2009年

2 陈立钻;倪云霞;孙继军;范华芬;许安玲;;铁皮石斛传统加工品与机械加工品的多糖含量对比研究[A];全国第六届天然药物资源学术研讨会论文集[C];2004年

3 郭英英;刘京晶;斯金平;;雁荡山不同树种活树附生铁皮石斛多糖含量差异比较[A];生态文明建设中的植物学：现在与未来——中国植物学会第十五届会员代表大会暨八十周年学术年会论文集——第4分会场：资源植物学[C];2013年

4 王伯初;李标;;响应声波加载的铁皮石斛差异表达基因筛选及其功能初步研究[A];2008年全国生物流变学与生物力学学术会议论文摘要集[C];2008年

5 丁小余;侯北伟;谢明璐;;珍稀铁皮石斛基于微卫星标记的种质鉴别与保护遗传学研究[A];第九届全国药用植物及植物药学术研讨会论文集[C];2010年

6 朱波;斯金平;苑鹤;;铁皮石斛杂交育种的初步研究[A];第九届全国药用植物及植物药学术研讨会论文集[C];2010年

7 李宏博;张宏宇;朴钟云;;铁皮石斛组织培养研究[A];第九届全国药用植物及植物药学术研讨会论文集[C];2010年

8 斯金平;;铁皮石斛可持续发展关键技术研究进展[A];第十届全国药用植物及植物药学术研讨会论文摘要集[C];2011年

9 金璐英;斯金平;张爱莲;魏涛;莫伊娜;;铁皮石斛中基本氨基酸含量变异规律[A];第十届全国药用植物及植物药学术研讨会论文摘要集[C];2011年

10 张治国;刘骅;夏志俊;王君晖;黄纯农;;铁皮石斛种子的超低温保存[A];中国植物生理学会全国学术年会暨成立40周年庆祝大会学术论文摘要汇编[C];2003年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 本报记者 王晶晶;[N];中国经济导报;2006年

2 施仁潮;[N];科技日报;2006年

3 张文聪;[N];韶关日报;2007年

4 本报记者 何潭振 戴正聪;[N];中国食品质量报;2006年

5 本报记者　 王蔚佳;[N];中国医药报;2006年

6 施文;[N];中国中医药报;2006年

7 本报记者 施仁潮;[N];中国中医药报;2008年

8 马盼盼;[N];中国现代企业报;2008年

9 周飞 段俊;[N];广东科技报;2010年

10 记者梁庆华 通讯员卢荫衔;[N];中国食品报;2011年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 徐程;铁皮石斛种质资源与组培工厂化生产研究[D];浙江大学;2006年

2 包英华;铁皮石斛种质资源的鉴定与评价研究[D];广州中医药大学;2014年

3 严亮;中国传统兰科药用植物铁皮石斛基因组及其生物学特性研究[D];吉林大学;2014年

4 张泽锦;铁皮石斛的光合碳同化途径及其对环境变化的生理响应[D];中国农业大学;2014年

5 赵兴兵;超微铁皮石斛对脾虚便秘小鼠肠道微生物的影响研究[D];湖南中医药大学;2014年

6 李标;声波刺激对铁皮石斛生长代谢的影响及其相关基因表达和克隆研究[D];重庆大学;2007年

7 滕建北;铁皮石斛与美花石斛茎尖生长机理及其多糖累积规律研究[D];成都中医药大学;2009年

8 关杰敏;铁皮石斛良种繁育与GAP种植关键技术研究[D];广州中医药大学;2014年

9 何铁光;铁皮石斛原球茎多糖的诱导、提纯、理化性质及生物活性研究[D];广西大学;2007年

10 李燕;铁皮石斛化学成分的研究[D];中国协和医科大学;2009年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 诸燕;铁皮石斛种质资源收集与评价[D];浙江农林大学;2010年

2 辛甜;组培铁皮石斛的品质评价研究[D];辽宁中医药大学;2011年

3 戴燕萍;铁皮石斛生产质量管理规范研究[D];浙江农林大学;2012年

4 王俊洁;铁皮石斛体细胞无性变异的生药学初步研究[D];云南中医学院;2012年

5 李东宾;冷胁迫下铁皮石斛抗寒基因的克隆与表达研究[D];浙江农林大学;2013年

6 郭洪波;铁皮石斛（Dendrobium candidum）组培快繁及其抗癌作用的研究[D];沈阳农业大学;2008年

7 李霖明;铁皮石斛菌根化育苗及重引入技术研究[D];海南大学;2011年

8 徐琳娜;茂兰喀斯特铁皮石斛环境适应性研究[D];贵州师范大学;2008年

9 朱波;铁皮石斛人工杂交技术与优良家系苗期选择[D];浙江农林大学;2011年

10 苑鹤;铁皮石斛主要活性成分遗传变异规律研究[D];浙江农林大学;2011年

  本文关键词：铁皮石斛中抗肿瘤活性物质的分离纯化，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：116416