L1脂肪细胞糖脂代谢的影响及机制研究

发布时间：2016-09-16 16:16

  本文关键词：黄连品质评价的研究及其应用，由笔耕文化传播整理发布。

《第三军医大学》 2012年

黄连五种单体对3T3-L1脂肪细胞糖脂代谢的影响及机制研究

王慧  

【摘要】：背景和目的 糖尿病是由于体内胰岛素绝对或相对不足所致的一种内分泌代谢性疾病，常伴有高脂血症。在传统中医中，糖尿病属消渴病的范畴，历代医书记载了大量治疗消渴病的中药及方剂，目前研究发现这些中药方剂大部分含有黄连或其主要成分黄连生物碱。黄连为毛莨科多年生草本植物，其根茎具有降低血糖、调节血脂的功效。现代医学研究显示，黄连的降糖调脂作用主要与其根茎所含的生物碱小蘖碱、药根碱、表小蘖碱、巴马汀、黄连碱等有关。小蘖碱是目前研究最多的黄连生物碱，具有改善高脂血症和胰岛素抵抗等作用。化学分析显示药根碱、表小蘖碱、巴马汀、黄连碱均是异喹啉生物碱，为小蘖碱的同系物，其化学结构与小蘖碱相似，有文献报道它们具有和小蘖碱相似的生物学功能，但目前为止其作用机制尚不清楚。 过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs)是一类由配体激活的核转录因子超家族成员,与配体结合后转录活性发生变化,从而导致PPARs靶基因表达的改变,进而引起脂肪生成、脂质代谢、胰岛素抵抗、糖耐量受损、肥胖等一系列生理活动。肝X受体а(Liver X recepetor aphal,LXRа)的靶基因已发现了十几种，其中大部分与糖代谢、炎症反应、细胞增殖及脂质代谢有密切关系，提示LXRа可能广泛参与了脂质代谢紊乱、2型糖尿病及动脉粥样硬化等多种疾病的发生发展。 本研究以3T3-L1脂肪细胞为研究对象，分别检测黄连五种单体对其葡萄糖摄取和脂肪酸氧化的影响，以及黄连单体处理脂肪细胞后PPARs、LXRα基因和蛋白表达的变化情况，以期明确黄连单体对糖脂代谢的可能作用机制，为黄连生物碱的临床应用提供实验依据。 方法： 1、3T3-L1前脂肪细胞按照ATCC推荐的方法培养，细胞长满6孔板后加入IBMX(终浓度0.5mmol/L)、地塞米松(终浓度1μmol/L)、胰岛素(终浓度10mg/L)诱导分化为脂肪细胞。分化成熟的脂肪细胞采用油红O染色的方法进行鉴定。 2、将分化成熟的脂肪细胞接种于96孔板，用黄连五种单体诱导细胞12小时、24小时、48小时、72小时，浓度分别为265.65μmol/L、53.75μmol/L、10.75μmol/L、2.15μmol/L、0.45μmol/L，采用空白组和PBS组作为对照组，吞噬MTT后检测其OD值，每组至少重复3孔。 3、五种单体均选用最适浓度处理3T3-L1脂肪细胞，PBS处理组作为阴性对照共培养48h，[3H]2-DG示踪检测3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取，14C-palmitic示踪检测3T3-L1脂肪细胞的脂肪酸氧化情况。 4、选用黄连五种单体的最适浓度处理细胞48h，采用空白组和PBS组作为对照组，，Real-time PCR检测其PPARs和LXRα基因表达情况，western blot检测其PPARs和LXRα蛋白表达的情况。 结果： 1、3T3-L1前脂肪细胞的培养、诱导分化和鉴定实验：3T3-L1前脂肪细胞在诱导分化为3T3-L1脂肪细胞的过程中，胞浆中脂肪滴有无到有，由小变大，细胞形态逐渐变圆，在诱导分化至第9-10天左右分化成熟，采用油红O染色后胞浆中脂肪滴被染成红色。 2、MTT检测结果：五种单体的最佳作用时间均为48h，小蘖碱、表小蘖碱的最佳作用浓度均为2.15μmol/L，巴马汀、黄连碱的最佳作用浓度均为10.75μmol/L，药根碱的最佳作用浓度为0.45μmol/L。 3、3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的结果：实验显示胰岛素有明显促进3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的作用；小蘖碱、表小蘖碱和巴马汀在胰岛素介导作用下均有促进3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的作用；药根碱和黄连碱对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取均没有统计学意义。 4、3T3-L1脂肪细胞脂肪酸氧化的结果：数据统计分析显示小蘖碱和药根碱处理组均具有促进3T3-L1脂肪细胞脂肪酸氧化的作用；表小蘖碱、巴马汀和黄连碱处理组均对3T3-L1脂肪细胞脂肪酸氧化没有统计学意义。 5、黄连五种单体对3T3-L1脂肪细胞PPARs和LXRα基因和蛋白表达影响： (1)Real-time PCR结果：与PBS对照组相比，黄连五种单体作用于3T3-L1脂肪细胞后均具有促进PPARα和PPARβ基因表达的作用；小蘖碱、药根碱还可促进LXRα的基因表达，而小蘖碱、表小蘖碱、巴马汀对PPARγ的基因表达与PBS对照组比较具有显著统计学差异。 (2)蛋白表达检测结果：与PBS对照组相比，小蘖碱和表小蘖碱处理组能够明显促进3T3-L1脂肪细胞PPARs和LXRα的蛋白表达水平；药根碱处理组能够显著上调3T3-L1脂肪细胞PPARα、PPARβ和LXRα的蛋白表达水平；而巴马汀处理组对3T3-L1脂肪细胞PPARβ和PPARγ蛋白表达水平具有促进作用。 结论： 1、MTT实验显示黄连五种单体对3T3-L1脂肪细胞的最佳作用时间均为48h，小蘖碱、表小蘖碱的最佳作用浓度均为2.15μmol/L，巴马汀、黄连碱的最佳作用浓度均为10.75μmol/L，药根碱最佳作用浓度为0.45μmol/L。 2、小蘖碱、表小蘖碱和巴马汀均可促进3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取，小蘖碱的作用机制可能与增加PPARs和LXRα基因和蛋白的表达有关；表小蘖碱和巴马汀可能是通过上调PPARα、PPARβ和PPARγ表达实现的。 3、小蘖碱和药根碱对3T3-L1脂肪细胞脂肪酸氧化具有促进作用，小蘖碱的作用机制可能与上调PPARs和LXRα表达有关，药根碱可能通过增加PPARα、PPARβ和LXRα的基因和蛋白表达来实现。

【关键词】：
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R587.1;R285.5
【目录】：

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