基于miR-135a调控作用探讨归肾丸治疗肾虚—薄型子宫内膜大鼠的机制研究

发布时间：2017-12-30 22:41

  本文关键词：基于miR-135a调控作用探讨归肾丸治疗肾虚—薄型子宫内膜大鼠的机制研究　出处：《广州中医药大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的：1.对目前成熟的两个动物模型肾虚大鼠模型和薄型子宫内膜大鼠模型进行有机整合,建立肾虚-薄型子宫内膜大鼠模型,模拟临床薄型子宫内膜患者证属肾虚者,对建模的步骤、使用药物及用药时间加以明确,为研究薄型子宫内膜提供更符合临床实际的病证结合模型,深入了解肾虚-薄型子宫内膜的病理特点,为探索有效的治疗方法提供实验基础。2.分析在归肾丸影响下miR-135a对子宫内膜JAK2/STAT3信号通路及HOXA10基因的调控作用,以期阐明归肾丸治疗薄型子宫内膜的靶点及药效机制,从而丰富古方临床适用范围,也为中医药在辅助生殖技术中的应用提供科学依据。方法：1.通过SD大鼠宫腔内注射95%乙醇和450mg/kg/天×8天羟基脲灌胃建立符合临床病证实际的肾虚—薄型子宫内膜大鼠模型。HE染色检测子宫内膜组织结构,测量子宫内膜厚度；免疫组化方法法检测子宫内膜细胞标志蛋白角蛋白和波形蛋白的表达,以及检测子宫内膜容受性标志蛋白VEGF蛋白的表达。2.建立肾虚-薄型子宫内膜大鼠模型后,采用归肾丸灌胃液低、高剂量干预,雌激素作为阳性药物对照组,两个动情周期后,HE染色检测子宫内膜组织结构,测量子宫内膜厚度；采用免疫组化法检测大鼠子宫内膜上波形蛋白、角蛋白、VEGF蛋白、COX-2蛋白等表达;采用western-blot法检测大鼠子宫内膜上JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3表达；采用qRT-PCR法检测大鼠子宫内膜上miR-135a、HOXA10基因、ITG β 3基因、EMX2基因的表达变化。结果：1.肾虚-薄型子宫内膜建模成功,形态学上,对照组子宫内膜结构完整,造模组子宫内膜变薄,内膜欠连续,皱褶减少,部分腺上皮脱落,腺上皮及内膜上皮细胞呈低柱状,甚至扁平状；间质可见纤维组织增生,腺体稀疏,可见部分腺体腺上皮萎缩；造模组的平均内膜厚度(453.95±60.46um)较对照组内膜厚度(709.13±114.05um)薄(P0.01)；造模组的脾脏、胸腺重量较对照组减轻(P0.01)。2.对照组的脾脏重量较其余各组均偏高(P0.05)；归肾丸低剂量组的脾脏重量较雌激素组、归肾丸高剂量组的高(P0.05)；对照组的胸腺重量较其余各组重,P值均0.05；归肾丸低、高剂量组的胸腺重量比造模组、雌激素组的重(P0.05)。3.造模组的子宫内膜厚度较其余各组均偏薄(P值均0.05)；对照组的子宫内膜厚度较其余各组均偏厚(P0.05)；归肾丸低、高剂量组与雌激素组比较无明显差异(PO.05)。4.各组的VEGF蛋白表达均高于造模组,P0.05,差异具有统计学意义；与对照组比较,雌激素组、归肾丸低、高剂量组的VEGF蛋白表达较高,P值均0.05,差异具有统计学意义；与雌激素组比较,归肾丸低剂量组的VEGF表达较高,P值均0.05；对照组以及归肾丸高剂量组的COX-2蛋白表达明显高于其余各组(P值均0.05)；雌激素组与归肾丸低剂量组比较无差异(P0.05),对照组与归肾丸高剂量组比较无差异(P0.05)5.雌激素组、造模组相比较各组的ITG β 3蛋白表达均偏低,P值均0.05,差异具有统计学意义；归肾丸低、高剂量组的的ITG β 3蛋白表达与对照组无明显差异(P0.05)。6.造模组与对照组JAK2蛋白表达比较无统计学差异(P0.05)；归肾丸各剂量组及雌激素组的JAK2蛋白表达均比造模组、对照组表达低(P值均0.05)；归肾丸高剂量组与雌激素组比较,归肾丸高剂量组的JAK2蛋白表达高,P0.05,差异具有统计学意义；造模组P-JAK2蛋白表达量较其余各组高(P0.05)；对照组及雌激素组的STAT3蛋白表达较造模组,归肾丸低、高剂量较造模组表达高(P值均0.05)；对照组和雌激素组的蛋白表达较归肾丸各剂量组高,(P值均0.05)；造模组的P-STAT3蛋白表达量与其余各组比较均偏高(P值均0.05)；归肾丸低、高剂量组的P-STAT3蛋白表达量均较对照组和雌激素组的低,P值均0.05。7.造模组的ITG β 3基因的相对表达量较其余各组偏高(P值均0.05)；雌激素组和归肾丸高剂量组的ITG β 3基因的相对表达量较对照组高(P0.05)；对照组和归肾丸低组之间比较无显著性差异(P0.05)。8.归肾丸低剂量组的的HOXA10基因相对表达量较其余各组偏高(P值均0.05)；造模组的HOXA10基因相对表达量与其余各组比较均偏低(P值均0.05)。9.与造模组比较,其余各组的miR-135a相对表达量均较造模组高(P值均0.05)；归肾丸高剂量组较对照组、归肾丸低剂量组偏高(P值均0.05)。10. miR-135a和JAK2蛋白表达高度负相关,r=-0.814,P0.01；miR-135a和P-JAK2低度负相关,r=-0.351,P0.01;miR-135a和P-STAT3蛋白表达中度负相关,r=-0.734,P0.01；miR-135a和STAT3蛋白表达不显著相关。11.JAK2和P-STAT3高度正相关,r=0.84,P0.01；P-JAK2蛋白与STAT3蛋白之间不相关。12.JAK2和VEGF蛋白表达中度负相关,r=-0.75,P0.01；P-STAT3和VEGF蛋白表达中度负相关,r=-0.762,P0.01；P-STAT3和COX-2蛋白表达低度负相关,r=-0.478,P0.01：VEGF蛋白表达和COX-2蛋白表达低度相关,r=0.304,P0.05。13. miR-135a和HOXA10基因表达不相关,r=0.273,P0.05；miR-135a和ITG β 3基因表达低度负相关,r=-0.307,P0.05；miR-135a和EMX2基因表达中度相关,r=-0.726,P0.01。14.HOXA10基因和ITG β 3基因表达中度负相关,r=-0.565,P0.01；EMX2基因和ITG β 3基因表达低度正相关,r=0.389,P0.01。HOXA10基因和ITG β 3蛋白表达中度正相关,r=0.772,P0.01结论：1.通过SD大鼠宫腔内注射95%乙醇和450mg/kg/天×8天羟基脲灌胃液灌胃可以建立符合临床病证实际的肾肾虚—薄型子宫内膜大鼠模型,模型基本可以反映临床薄型子宫内膜肾虚证的实际状况。2.归肾丸能够有效改善肾虚-薄型子宫内膜大鼠的肾虚相关症状,并且有效增加子宫内膜厚度,增强VEGF蛋白、COX-2蛋白以及ITG β 3蛋白在薄型子宫内膜的表达,有效促进子宫内膜的增生修复。因此,可以在辅助生殖技术中对于薄型子宫内膜肾虚证患者加以归肾丸作为辅助,以期提高患者妊娠成功率。3.归肾肾丸对JAK2、STAT3、P-JAK2以及P-STAT3蛋白的表达均具有抑制作用。归肾肾丸低、高剂量组均对miR-135a的表达具有增强作用,其中以归肾丸高剂量组尤其显著；归肾丸低、高剂量组均对EMX2基因的表达具有抑制作用,其中以归肾丸高剂量组尤其显著；归肾丸对ITG β 3基因的表达具有抑制作用；归肾丸作为一个多靶点的复方汤剂,其复杂的药效机制对多个基因及蛋白的表达均有影响,本研究为进一步的归肾丸药物研发提供了一定的理论基础和科学依据。4.基于miR-135a的调控作用,归肾丸治疗肾虚-薄型子宫内膜大鼠作用机制,通过上调miR-135a在子宫内膜的表达,对EMX2基因具有负性调节作用,从而达到改善子宫内膜容受性。miR-135a与HOXA10基因不相关,归肾丸干预可以上调HOXA10基因的表达,增强子宫内膜的ITG β 3蛋白表达,从而达到改善子宫内膜容受性。
[Abstract]:Objective : 1 . To establish a model of renal deficiency - thin endometrium in rats with renal deficiency - thin endometrium . Compared with the control group , the expression of VEGF in the group was higher than that in the control group ( P0.05 ) . Compared with the control group , the expression of VEGF protein in the group was higher than that in the control group ( P0.05 ) . There was a negative correlation between the expression of the protein of the control group and the estrogen group ( P < 0.05 ) . The relative expression of the protein of the control group and the group was higher than that in the control group ( P < 0.05 ) . The results showed that the expression of the gene and ITG尾3 gene were moderately correlated to the expression of the gene and the ITG尾3 gene expression . The results showed that the kidney - deficiency - thin endometrium model could be used to improve the expression of the gene and the ITG尾3 gene . so that the expression of the HOXA10 gene can be increased , the expression of ITG尾3 protein in the endometrium is enhanced , and the tolerance of the endometrium is improved .

【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R271.9

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本文编号：1356861