贞芪益肝方对急性免疫性肝损伤保护作用的临床与实验研究

发布时间：2018-01-12 09:01

本文关键词：贞芪益肝方对急性免疫性肝损伤保护作用的临床与实验研究　出处：《广州中医药大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性流行,已成为严重威胁人类健康的公共卫生问题。研究认为,HBV诱导的机体适应性免疫是造成肝脏炎症的罪魁祸首,而非HBV本身。免疫机制是慢性乙型肝炎发病的主要机制。目前该病的主要治疗手段有抗病毒、免疫调节、改善肝功能和抗肝纤维化等。抗病毒药物包括核苷(酸)类似物和干扰素。但核苷(酸)类似物易导致病毒变异；干扰素适应面窄,副作用大,价格昂贵,远期疗效欠佳。且这些药物对作为病毒RNA复制模板的共价闭合环状DNA(cccDNA)均无作用,难以彻底清除病毒,停药后复发率较高。导师认为,慢性乙型肝炎是因机体正气不足,湿热疫毒侵袭而致。病变由气入血,肝脾不调,故见腹胀、纳呆及乏力；血脉受病,肝络瘀阻,发为胁痛,胆汁内淤,溢为黄疸。治疗上应扶正祛邪并举。经多年临床实践,创制出贞芪益肝方。全方由黄芪、女贞子、灵芝、田基黄、首乌藤、板蓝根等12味药物组成,具有益气养阴、清热利湿、解毒扶正的功效。对慢性乙型肝炎有较好的临床疗效。为总结推广该方,我们开展了该方治疗急性免疫性肝损伤的临床与实验研究。临床研究方面,通过和西药恩替卡韦片的随机对照研究,评价该方的临床疗效；实验研究方面,以尾静脉注射刀豆蛋白A制备免疫性肝损伤动物模型,分别从对肝细胞坏死、凋亡及再生作用方面评价该方疗效,探讨其抗肝损伤的作用机制。方法：1.临床研究共观察71例慢性乙型肝炎患者,治疗组40例,用贞芪益肝方治疗,每日一剂,每次煎服300ml,每天2次；对照组31例,用抗病毒药物恩替卡韦片治疗,每次0.5mg,每日一次。两组均治疗6个月,分析治疗前后的症状体征积分、肝功能及病毒学指标变化情况。2.实验研究将120只雌性KM小鼠随机分为6组：贞芪益肝方高、中、低剂量组、联苯双酯组、模型组和正常对照组。除正常对照组外,其他各组予刀豆蛋白A(15mg/kg)尾静脉注射制备急性免疫性肝损伤模型。造模成功后,贞芪益肝方各剂量组及联苯双酯组给予相应药物灌胃,模型组及正常对照组则给予等体积生理盐水灌胃,共治疗7天。每天分别从各组中取3只小鼠,取血及肝脏标本,应用ELISA法检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、干扰素-γ (IFN-γ)、中瘤坏死因子-α (TNF-α)、白介素4(IL-4)、白介素6(IL-6)和白介素10(IL-10)水平；应用免疫组化法检测肝组织中Fas、FasL、Bax、Bcl-2、 PCNA含量。实验结果以均数±标准差表示,采用重复测量方差分析比较各组疗效,以P0.05为有统计学差异。成果：1.临床研究两组患者在性别、年龄、病史、病情分级、症状体征积分、肝功能、血清HBV-DNA水平等基线资料比较上无统计学差异(P0.05)。6个月后的临床观察统计结果显示：①治疗组和对照组均能改善患者的临床症状及体征,治疗组在改善患者的胃部满闷、腹部胀满、寐艰多梦、大便粘滞和小便黄赤症状方面优于对照组(P0.05)；②治疗组和对照组均能促进血清HBeAg阴转,降低血清HBV-DNA水平,改善患者肝功能,两组比较无统计学差异(P0.05)；③在临床疗效比较方面,治疗组总有效率为55%,对照组为51.6%,但两组比较无显著统计学差异(P0.05)；④在证候疗效比较方面,治疗组总有效率为95%,对照组为77.4%,治疗组优于对照组(P0.05)。2.实验研究(1)贞芪益肝方对小鼠血清ALT、AST水平的影响经刀豆蛋白处理后,与正常对照组比较,模型组、贞芪益肝方各剂量组及联苯双酯组血清ALT和AST水平均不同程度升高(P0.01)。与模型组比较,贞芪益肝方各剂量组及联苯双酯组血清ALT及AST升高幅度减少,在血清AST降低幅度上,高剂量组优于联苯双酯组(P0.05)。(2)贞芪益肝方对小鼠血清MDA、SOD水平的影响经刀豆蛋白处理后,与正常对照组比较,模型组、贞芪益肝方各剂量组及联苯双酯组血清MDA水平均不同程度升高,SOD水平均不同程度降低(P0.01)。与模型组比较,高中低剂量组及联苯双酯组血清MDA升高幅度及SOD降低幅度减少。在血清SOD降低幅度上,高剂量组优于联苯双酯组(P0.05)。(3)贞芪益肝方对小鼠血清TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6及IL-10水平的影响经刀豆蛋白处理后,与正常对照组比较,模型组、贞芪益肝方各剂量组及联苯双酯组血清TNF-α、IFN-γ、IL-6水平均有不同程度升高,IL-4、IL-10水平均有不同程度降低(P0.01)。与模型组相比,贞芪益肝方各剂量组及联苯双酯组升高及降低幅度均减少。除血清IFN-y外,高剂量组优于联苯双酯组(P0.05)。(4)贞芪益肝方对小鼠肝组织Fas、FasL、Bax、Bcl-2、PCNA含量的影响经刀豆蛋白处理后,与正常对照组比较,模型组、贞芪益肝方各剂量组及联苯双酯组Fas、 FasL、Bax、PCNA表达水平均不同程度升高,BCL-2表达水平不同程度下降(P0.01)。与模型组比较,贞芪益肝方各剂量组及联苯双酯组Fas、FasL、Bax、PCNA表达水平升高,BCL-2表达水平下降；在PCNA表达水平方面,贞芪益肝方高剂量组优于联苯双酯组。(5)肝脏病理学观察：正常对照组肝小叶中央可见中央静脉,小叶中可见肝细胞组成的肝板结构,肝板之间为肝血窦；模型组肝小叶中可见大片状坏死区域,周围可见炎性细胞浸润,小叶结构破坏；贞芪益肝方高剂量组和联苯双酯组肝小叶中肝细胞肿胀明显呈气球样改变；贞芪益肝方中剂量组肝小叶中可见点状坏死区域,周围可见炎性细胞浸润；贞芪益肝方低剂量组肝小叶中央静脉周围可见点状坏死区域,周围可见炎性细胞浸润。结论：1.临床研究贞芪益肝方能改善慢性乙型肝炎患者的临床症状体征及肝功能；降低病毒载量；有较高的血清转换率；能有效治疗慢性乙型肝炎。2.实验研究：(1)小鼠经尾静脉注射刀豆蛋白A后,8小时后血清ALT及AST水平明显升高,造模成功。(2)应用贞芪益肝方后,与模型组相比,小鼠血清ALT及AST水平明显降低,说明贞芪益肝方对免疫性肝损伤小鼠模型具有保护作用,具有显著的保肝降酶作用。(3)应用贞芪益肝方后,与模型组相比,小鼠血清MDA水平升高及SOD降低幅度减少,说明贞芪益肝方具有抗氧化、减轻肝损伤的作用。(4)应用贞芪益肝方后,与模型组相比,血清TNF-α、IFN-γ及IL-6水平升高幅度及IL-4和IL-10降低幅度均减少,病理损害减轻。说明贞芪益肝方可能通过下调促炎因子,上调抑炎因子,调节Thl/Th2因子平衡来减轻肝损伤。(5)应用贞芪益肝方后,与模型组相比,肝组织中Fas、FasL、Bax、PCNA表达水平均不同程度升高,Bcl-2表达水平下降,推测贞芪益肝方具有促进受损肝细胞凋亡,促进肝细胞再生而发挥保肝作用。
[Abstract]:Objective : Hepatitis B virus ( HBV ) infection has become a worldwide epidemic and has become a major threat to human health . It is believed that HBV - induced immune response is the main cause of chronic hepatitis B . Serum levels of Fas , FasL , Bax , Bcl - 2 and PCNA in liver tissues were determined by immunohistochemical method . Compared with the control group , the serum levels of ALT and AST in both groups were higher than those in the control group ( P0.05 ) . ( 3 ) The levels of Fas , FasL , Bax , Bcl - 2 and PCNA in serum TNF - 伪 , IFN - 纬 , IL - 4 , IL - 6 and IL - 10 in mice were significantly higher than those in normal control group ( P0.01 ) . ( 5 ) Liver pathology observation : In normal control group , the central vein was seen in the middle of the hepatic lobule , the hepatic plate structure composed of hepatocytes was seen in the middle hepatic lobule of the normal control group . The results showed that the serum ALT and AST levels were significantly decreased after 8 hours . The results showed that the serum levels of TNF - 伪 , IFN - 纬 and IL - 6 were significantly decreased in the middle dose group and the model group . ( 5 ) The expression level of Fas , FasL , Bax and PCNA in liver tissues increased in different degrees compared with model group , and Bcl - 2 expression level decreased after applying Zhenqi Yigan prescription .

【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R259

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