基于下丘脑STAT5-IGF1信号通路的针刺减肥作用机制研究

发布时间：2018-03-11 10:52

本文选题：电针　切入点：肥胖　出处：《南京中医药大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：研究电针“足三里”、“内庭”穴对中枢条件性敲除Stat5巴胖小鼠的减肥效应及对下丘脑和附睾脂肪全基因组基因表达谱的改变,从下丘脑STAT5-IGF1信号通路角度探讨针刺减肥的多通路多靶点的整体调整机制,为针刺减肥的临床应用与推广提供更加可靠的科学证据。方法：将周龄12周雄性Stat5fl/fl和Stat5NK0小鼠随机编码分成4组：Stat5fl/fl组,Stat5fl/fl+EA组,Stat5NK0组和Stat5NKO+EA组,其中Stat5fl/fl组仅固定,Stat5fl/fl+EA组固定加针刺,Stat5NK0组仅固定,Stat5NKO+EA组同样固定加针刺。四组小鼠记录初始体重后,取准单侧“后三里”、“内庭”穴位后(双侧轮换使用)75%酒精消毒,针入2-4毫米,得气后,接电针(韩氏电针仪HANS-200E, 0.5～1mA,2/15Hz)30分钟,疏密波。每天1次。治疗6天休息1天(休息当天禁食6h称量体重)为1个疗程,共治疗4个疗程。第一部分,电针“足三里”、“内庭”穴减肥效应的研究：首先每周定期观察小鼠体重和摄食量的改变,采用比色法结合酶联免疫吸附法测量血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、血糖(Glu)以及瘦素(Leptin)的变化,运用苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin staining, HE)染色法光镜下观察分析附睾脂肪细胞的形态与大小,最后进行冷库抗寒实验和代谢笼监测系统评价小鼠的代谢能力,综合各方面来评价针刺的减肥效应。第二部分,电针“足三里”、“内庭”穴减肥效应的全基因组基因表达谱研究：运用RNA-seq高通量测序技术,结合用Tophat、Cufflinks等软件进行基因表达水平计算,继用UCSC genome browser来比对基因,对样本的分类比较用GO (Gene ontology), KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)的方法。检测Stat5fl/fl组,Stat5fl/fl+EA组,Stat5NKO组和Stat5NKO+EA组四组基因表达谱进行深度测序及比对,分析电针减肥的靶基因表达水平和信号通路。将周龄6-8周的C57BL6J野生型小鼠随机编码根据实验目的分组,IGF1注射实验按照数字随机表随机分为生理盐水组和IGF1注射组(正向实验)；anti-IGF1注射实验按照数字随机表随机分为生理盐水组和anti-IGF1注射组(反向实验)；AAV-Igfl注射实验首先检测过表达效率然后按照数字随机表随机分为AAV-empty(空载)组和AAV-Igfl实验组。第三部分,电针对中枢条件性敲除Stat5肥胖小鼠下丘脑STAT5-IGF1信号通路的影响：首先用Western Blot法检测Stat5fl/fl组,Stat5fl/fl+EA组,Stat5NKO组和Stat5NKO+EA组四组小鼠以及高脂诱导肥胖的C57BL6J野生型小鼠下丘脑中IGF1的表达。同样定期观察各种注射条件下小鼠体重和摄食量的改变,再检测血清中血糖和胰岛素水平的变化,然后采用IGTT (Intravenous Glucose Tolerance Test)和ITT (Insulin Tolerance Test)法检测小鼠的糖耐量程度和胰岛素敏感性,进一步用Western Blot法检测小鼠肝脏中胰岛素信号通路相关蛋白(包括p-IRβ /t-IRβ,p-AKT/t-AKT等)的同时用酶联免疫吸附Elisa法检测肝脏中糖元和甘油三酯的含量,最后运用荧光定量PCR法检测小鼠下丘脑中与摄食相关基因Pomc、 Npy的表达,分析电针可能起效的作用机制。结果：第一部分,从小鼠的体重、摄食量、体脂比、脂肪细胞形态大小、血清学生化指标和抗寒代谢能力方面,电针“足三里”、“内庭”穴具有减肥作用。与Stat5fl/fl组比较,Stat5NKO组小鼠体重(P0.01)和摄食量增加(P0.05)；体脂比升高(P0.05),脂肪细胞体积增大(P0.01)；血清瘦素、血糖、甘油三脂、胆固醇水平升高(P0.01)；冷库抗寒能力下降(P0.01)。与Stat5NKO组相比,电针能有效降低小鼠体重(P0.01)和体脂比(P0.05),减小脂肪细胞体积(P0.01)；降低了血清瘦素、血糖(P0.01)、甘油三脂、胆固醇水平(P0.05)；冷库抗寒能力上升(P0.01)。第二部分,采用RNA-seq高通量测序技术,通过全基因表达水平检测,电针“足三里”、“内庭”穴改变了中枢条件性敲除Stat5小鼠的基因表达谱。结果显示在下丘脑中与Stat5fl/fl组比较,Stat5NKO组有420个基因被改变,其中80%上调,20%下调(P0.05),由此可见Stat5是一个负性的转录调节因子；与Stat5NKO组相比,电针“足三里”、“内庭”穴有405个基因被改变,其中91.4%下调,仅有8.6%上调。在附睾脂肪中与Stat5fl/fl组比较,Stat5NKO组共有2153个基因被改变,其中48.6%上调,51.4%下调；与Stat5NKO组相比,电针“足三里”、“内庭”穴仅有454个基因被改变,其中79.5%上调,20.5%下调。在下丘脑和附睾脂肪中表达水平被改变的基因表达谱中,Stat5敲除后下丘脑和附睾脂肪中共同改变基因所涉及的信号通路有：ECM受体相互作用、PPAR信号通路、细胞黏附、甘油酯类及甘油磷酸酯类代谢。而电针“足三里”、“内庭”穴后逆转的基因所涉及共同的信号通路除了上述改变的之外,电针还改变了与脂肪细胞及代谢直接相关的脂肪细胞因子、脂肪酸代谢、细胞因子受体相互作用、花生四烯酸代谢的信号通路以及胰岛素信号通路,其次有细胞黏附分子、血管平滑肌收缩、系统性红斑狼疮等信号通路。第三部分,生物信息学分析发现胰岛素信号通路在电针“足三里”、“内庭”穴后的改变,继用Western Blot法检测IGF1表达确认后发现,与Stat5fl/fl组比较,IGF1表达升高,但电针可降低IGF1的表达；而在高脂诱导的肥胖小鼠下丘脑中IGF1的表达也升高,与中枢条件性敲除Stat5小鼠下丘脑中结果一致。进一步探讨中枢IGF1在肥胖形成过程中的作用显示：IGF1可以促进食欲(P0.01),与抑制下丘脑Pomc的表达相关(P0.01)；而增强糖耐量耐受和胰岛素敏感性(P0.01),降低肝脏中甘油三酯和糖元的含量(P0.01),可能与增强肝脏胰岛素信号通路中相关蛋白的表达(P0.01)和提高棕色脂肪中UCP1的表达(P0.01)有关。结论：1.电针对中枢条件性敲除Stat5肥胖小鼠具有减肥作用。2.电针对中枢条件性敲除Stat5肥胖小鼠的减肥作用可能与逆转Stat5缺失导致肥胖引起表达水平改变的基因谱有关。3.Igfl作为Stat5的下游靶基因可以促进食欲,改善糖耐量,增强靶器官胰岛素敏感性。4.针刺减肥的作用靶点并不是直接调控Igf1,下丘脑IGF1表达的升高可能是肥胖发生时机体代偿性改变。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R245

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