基于转录组学及代谢组学的芪灯明目胶囊治疗糖尿病视网膜病变作用机制研究

发布时间：2018-03-19 02:37

本文选题：糖尿病视网膜病变　切入点：芪灯明目胶囊　出处：《成都中医药大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的以转录组学及代谢组学为技术支撑,研究芪灯明目胶囊对糖尿病视网膜病变(DR)大鼠视网膜基因表达及血浆内源性代谢物的影响,通过分析差异表达基因的生物信息学及潜在生物标志物的代谢通路,并结合与血管新生、氧化应激和炎症反应相关的指标,阐明芪灯明目胶囊治疗糖尿病视网膜病变的药效及其作用机制。方法1.雄性SD大鼠,高脂饲料喂养6周后,腹腔一次性注射40mg·kg~(-1)新鲜配制的链脲佐菌素(STZ),72 h后选用血糖值≥16.67 mmol/L (禁食4 h)的大鼠作为糖尿病模型动物,继续喂养诱导DR模型。给予STZ 16及20周时通过视网膜HE染色、血管消化铺片及透射电镜进行糖尿病视网膜病变模型评价。2.造模成功后,DR大鼠随机分为模型对照组,羟苯磺酸钙组,芪灯明目胶囊组,葛根提取物组,灯盏细辛提取物组,黄芪提取物组,连续灌胃给药10周后采集血液样本,进行血管内皮生长因子(VEGF)、血管紧张素ⅠI (ANGⅡ)、肿瘤坏死因子-a (TNF-α)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、一氧化氮(NO)、缺氧诱导因子la (HIF-1α)、血浆超氧化物歧化酶1(SOD1)、丙二醛(MDA)的含量测定,采用主成分分析受试药物对以上药效学指标的干预效果。3.芪灯明目胶囊及各组分干预10周后,分离视网膜,采用Trirol法提取视网膜总RNA,1.5%琼脂糖凝胶电泳、Agilent 2200 TapeStation进行RNA定量及质检,采用高通量转录组测序(RNA-seq)技术,筛选差异表达基因,并通过GO和KEGG对差异表达基因进行生物信息学分析。4.采用超高效液相色谱-四极杆-轨道阱质谱(UPLC-Q-ExactiveOrbitrap-MS)进行DR大鼠血浆样品检测,主成分分析(PCA)结合最小二乘法-判别分析(PLS-DA)和经校正的偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)进行模式识别,筛选潜在生物标记物,搜索KEGG, Lipidmaps及Metlin数据库获得潜在生物标志物的信息及代谢通路。结果1.与正常对照组比较,DR模型大鼠体重减轻,血糖显著升高。视网膜组织HE染色结果表明DR模型大鼠视网膜内各层结构松散、细胞排列不规则；视网膜神经节细胞排列紊乱,数目减少,内丛状层肿胀,毛细血管扩张,内皮细胞增生,出现外丛状层毛细血管。视网膜血管迂曲,走向不规则,管径变细。透射电镜下DR模型视网膜毛细血管内皮细胞核聚集,胞浆内线粒体肿胀,视杆细胞外节盘排列紊乱,粗面内质网扩张,核糖体减少。正常对照组视网膜未见明显异常。2.芪灯明目胶囊及各组分对DR大鼠体重、血糖均无明显影响,芪灯明目胶囊及葛根提取物组血糖有降低趋势。与正常对照组比较,DR大鼠ANGⅡ、VEGF、 ICAM-1、HIF-1α、MDA含量显著增加,SOD1含量显著降低。与模型组比较,芪灯明目胶囊可显著降低ANGⅡ、VEGF、HIF-1α、MDA水平,增加SOD1水平;葛根提取物可显著降低VEGF和MDA含量,升高SOD1含量；灯盏细辛提取物可显著降低VEGF和ANGⅡ含量；黄芪提取物显著降低MDA含量；各受试药物对TNF-α和NO均无明显影响。3.在DR模型共筛选出785条差异表达基因,其中上调基因占绝大部分。其差异表达基因在KEGG中富集的通路主要包括：PI3K-Akt信号通路,细胞粘附分子,MAPK信号转导通路,细胞因子-细胞因子受体相互作用,粘着,趋化因子信号转导通路,JAK-STAT信号通路,补体和凝血级联反应,肿瘤坏死因子途径,核因子-KB信号通,血小板活化,紧密连接,HIF-1信号通路。与DR模型组比较,芪灯明目胶囊组、葛根提取物组、灯盏细辛提取组及黄芪提取组分别筛选出146、50、34、12条差异表达基因。芪灯明目胶囊组在信号通路分析中差异表达基因富集的通路主要为氧化磷酸化,谷胱甘肽代谢,PI3K-Akt信号通路,cAMP信号通路,HIF-1信号通路,过氧化物酶体,氨基酸代谢有关通路,脂质代谢；与模型组比较,葛根提取物中差异表达基因主要富集在糖酵解途径,氨基酸及脂质代谢通路,灯盏细辛提取物组差异表达基因主要富集在视黄醇代谢及血管平滑肌收缩,p53信号通路,紧密连接,补体和凝血级联。4.代谢组学研究中通过PLS-DA分析,筛选并鉴定出11个潜在生物标志物,包括PC(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z)/18:1(11Z)), PC(22:0/12:0), PC(21:0/0:0)[U], Leu Ser Lys Lys, Phylloquinone, Gly His Arg Gly, Lys Lys Ser,5'-Methylthioadenosine, 2-Hexylglycerol,7-keto-n-caprylic acid,7-Oxoheptanoic acid,这些生物标记物主要涉及氨基酸、脂代谢及凝血功能。芪灯明目胶囊及葛根提取物对糖尿病视网膜病变所致代谢紊乱改善作用最强,可显著调节各生物标志物的异常改变。结论糖尿病视网膜病变导致机体多条信号通路的激活,氧化应激、炎症、血管异常新生及氨基酸、脂代谢紊乱在其病理改变中起着重要作用。芪灯明目胶囊治疗糖尿病视网膜病变主要作用机制与改善氨基酸、脂代谢紊乱,抑制氧化应激损伤及新生血管的形成有关；葛根提取物为其主要活性组分。
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【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R259;R276.7

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