多基原民族药沙棘的多维鉴定方法研究

发布时间：2018-11-06 19:04

【摘要】：沙棘(胡颓子科Elaeagnaceae沙棘属Hippophae)是我国藏族(藏药名：达尔布)、蒙古族(蒙药名：其察日嘎纳)、维吾尔族(维药名：吉汗)等少数民族的常用药材,距今已有2000多年的用药历史。因其具有利肺止咳、活血化瘀、利心脏血脉、消痰浊等作用特点,广泛应用于藏、蒙、维吾尔等医药中。据《中国药典》《中华人民共和国卫生部药品标准·藏药》(第一册)《四川省藏药材标准》《内蒙古蒙药材标准》以及《维吾尔药志》等记载,沙棘(H. rhamnoides)(包括多个亚种)、江孜沙棘(H. gyantsensis)、西藏沙棘(H. tibetana)等多个物种均作为沙棘药材的基原在使用。作为典型多基原民族药,沙棘因其基原多样性以及同属植物的形态相似性,混用、误用以及替代使用的情况多有发生,严重影响沙棘药材的质量控制以及临床使用的“疗效等同性”。因此,利用现代仪器设备和分析方法,对药用和非药用沙棘进行快速、客观、准确的鉴定,是保证沙棘正确使用,确保其临床疗效,以及推动其现代化、标准化和产业化的必经之路。目的：为了快速、准确鉴定多基原民族药沙棘,采用DNA条形码和高分辨率熔解曲线技术(HRM)对产自中国的7种7个亚种的沙棘数植物进行分子生物学鉴定研究。应用~1H-NMR代谢组学方法探究7种7个亚种的沙棘药用部位(果实)代谢成分的差异,并寻找种间代谢标志物；运用红外三级鉴定(Tri-step IR)技术建立7种7个亚种沙棘药用部位的红外指纹图谱,寻找其共性与个性特征。本研究将分子生物学、代谢组学及tri-step红外光谱技术联合应用,以期建立复杂多基原民族药沙棘的多维鉴定方法,并对临床用药的正确选择提供理论依据。方法：(1)提取药用沙棘和同属植物DNA,采用通用引物ITS2 (2F/3R)和psbA-trnH(psbAF/trnHF)进行PCR扩增,并对扩增成功的PCR产物进行测序。采用CodonCode Aligner校对序列质量并进行拼接,采用MEGA比对序列,计算种内种间K2P距离,构建系统进化NJ树,同时根据遗传距离分布特征评价barcoding gap,最终对药用和非药用沙棘进行DNA条形码分子鉴定。(2)选择ITS2通用引物,应用DNA条形码结合HRM技术的Bar-HRM对药用沙棘及其同属植物进行鉴定。采用植物组织DNA提取试剂盒提取实验样本总DNA,通过Rotor-Gene Q MDx荧光PCR仪上进行PCR,获得药用沙棘及其同属植物,以及市场药材样本的熔解曲线和T_m值。比较市售沙棘药材与基原植物的熔解曲线,并通过PCA分析观察沙棘基原植物和市场药材样本T_m值的分布特征,从而对其进行快速鉴定。将HRM基因分型后的PCR产物进行测序,并将结果提交到中药材DNA条形码鉴定系统进行序列比对,验证Bar-HRM结果。(3)应用~1H-NMR代谢组学方法,建立药用沙棘及其同属植物果实的~1H-NMR代谢指纹图谱,鉴定主要代谢成分。结合PCA和PLS-DA等多元统计分析对药用和非药用沙棘进行化学分类研究,并分析种间代谢标志物。定量分析信号分离较好的代谢成分,并采用单因素方差分析判定种间含量差异是否具有统计意义。(4)应用tri-step IR光谱法建立7种7个亚种沙棘果实,以及药用沙棘果实提取物的tri-step IR指纹图谱,并对主要吸收峰进行归属。采用PCA对不同沙棘以及药用沙棘果实提取物进行化学分类分析。同时比较药用沙棘果实提取前后的红外指纹图谱中吸收峰的位置、形状和强度,归纳变化规律。结果：(1)沙棘属植物ITS2序列长度在221-223 bp之间,比对后共发现43个变异位点、23种单倍型,psbA-trnH序列长度在300-313 bp之间,比对后共发现19个变异位点、23种单倍型。基于ITS2、psbA-trnH和组合序列ITS2+psbA-trnH的平均种间K2P距离均大于平均种内K2P距离。Barcoding gap和系统进化NJ树结果表明,组合序列ITS2+psbA-trnH无论在种级或是亚种水平都显示出更高的鉴定效率,单独使用ITS2或psbA-trnH序列也能够鉴定绝大多数药用沙棘与非药用沙棘。(2)比较药用沙棘及其同属植物熔解曲线,能够快速从种级和亚种水平上鉴定不同沙棘物种。通过与已知沙棘基原植物的熔解曲线、T_m值的PCA分布特征的比较,也可以对市场药材进行快速鉴定。鉴定结果也表明市场沙棘药材存在一定的掺伪现象。(3)从~1H-NMR代谢指纹图谱中共鉴定出了甾醇类、五环三萜类、脂肪酸类、氨基酸类、糖类、黄酮苷元及黄酮苷类等36个成分。PCA和PLS-DA分析表明,不同沙棘能够以物种/亚种为单位各自聚在一起,齐墩果酸、丙氨酸、脂肪酸类、苹果酸、胆碱、奎宁酸等为种间代谢标志物。~1H-NMR定量分析结果表明,不同沙棘的代谢标志物含量各有差异,但这些成分在绝大多数药用沙棘中的含量都高于非药用沙棘。单因素方差分析Turkey多重检验表明上述代谢成分含量在种间的差异具有统计学意义。(4)建立了7种7个亚种沙棘果实,以及4种药用沙棘提取物的FT-IR、 SD-IR和2D-IR指纹图谱,并对主要吸收峰进行了归属：黄酮类、糖类和脂肪酸类化合物中O-H. C-O、C=C、=C-O-C以及C-H等主要官能团均在tri-step IR指纹图谱有相应的吸收峰。此外,比较药用沙棘提取物与原药材的IR指纹图谱发现,提取物主要官能团的吸收峰强度均有所增加。PCA结果表明各物种也因化学成分的差异以物种为单位聚在一起。结论：(1)DNA条形码能够快速、准确鉴定绝大多数药用和非药用沙棘。在实际鉴定工作中,可以根据所需要鉴定物种的实际情况选择较为合适的DNA barcode,以达到鉴定目的。该方法的成功运用为寻找沙棘属植物的最佳鉴别序列和快速鉴定方法提供参考和依据。(2) Bar-HRM技术作为一种具有方法通用性和数据可视化特点的鉴定方法,不但可以实现对多基原药材的基原,以及市场药材真伪的快速鉴定,同时也可作为DNA条形码的补充方法,解决一些亚种鉴定困难等方面的问题。该方法为市场药材的快速检测和其他多基原民族药材的快速鉴定提供新的方法参考。(3)苹果酸、胆碱、奎宁酸、L-白雀木醇、α/β-D-葡萄糖等代谢标志物可以作为物种鉴别的重要指标,并实现不同沙棘的化学分类鉴定。基于~1H-NMR代谢组学方法还可以同时对沙棘中的代谢成分进行定性定量分析,可以作为沙棘药材或其他民族药化学鉴定和质量评价的新方法。(4)在7种7个亚种沙棘果实的tri-step IR指纹图谱中,吸收峰位置和强度的异同点可作为化学分类的依据。药用沙棘果提取物IR指纹图谱的吸收峰强度较原药材整体增强,表明民族药沙棘传统用药形式水提物和醇提物的科学性和合理性。该方法快速、无损、准确,并为现代监控手段分析传统民族药的思路提供依据。创新点：(1)本论文采用基于ITS2和psbA-trnH序列的DNA条形码分子鉴定方法以及基于DNA条形码和高分辨熔解曲线(HRM)的Bar-HRM快速检测技术,对7种7个亚种沙棘进行了鉴定研究,建立了相应的ITS2和psbA-trnH序列的DNA条形码数据库,以及熔解曲线参考基因型。此外,Bar-HRM方法对DNA条形码鉴定存在难度的鼠李沙棘和肋果沙棘的亚种进行了基因分型和鉴定；同时也可对市场药材进行快速检测,判别其真伪。此项研究为药用、非药用沙棘和市场药材的分子生物学快速鉴定提供了新方法。(2)本论文采用~1H-NMR代谢组学方法,首次对产自中国的7种7个亚种沙棘果实进行分析,建立代谢物指纹图谱,检测鉴定36种代谢成分。此外,结合多元统计分析等方法发现种间代谢标志物,并进行了NMR定量分析。(3)本论文采用tri-step红外光谱法建立了7种7个亚种沙棘果实,以及药用沙棘果提取物的tri-step IR指纹图谱,并对主要吸收峰进行了归属,并发现了不同基原沙棘的异同之处。同时结合PCA方法对不同基原沙棘以及药用沙棘提取物进行了化学分类研究。这为沙棘药材及提取物等传统用药形式的合理性的快速分析监控提供新的参考方法。(4)本论文结合分子生物学快速鉴定、代谢组学和tri-step红外光谱法对多基原民族药沙棘进行鉴定研究,充分发挥各方法的优势之处,从遗传和化学双角度实现辨真伪与定质量的研究目的,并为沙棘的鉴定、化学分类以及质量评价研究提供了新思路。
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【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R29
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本文编号：2315186