【摘要】：背景心肌纤维化(myocardial fibrosis,MF)是影响心脏功能的常见病理改变,高血压、心肌梗死、肺动脉高压、代谢综合征、心脏瓣膜病、心律失常等疾病均可导致心肌纤维化的发生,心肌纤维化的发生发展又使心律失常、心力衰竭、猝死等心血管疾病的发生率增加。对于心肌纤维化的研究已有很长的历史,目前大多学者认为心肌纤维化是由细胞外基质(extracellular matrixc,ECM)(尤其是Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维)代谢异常而过度沉积导致。大量研究证明,在各种导致心肌纤维化的因素中,肾素-血管紧张素-醛固酮系统(Renin-angiotensin-aldosterone System,RAAS)激活占据主导地位,大量实验显示,作为RAAS中主要的活性物质血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)可诱导心肌纤维化的发生,近年来随着血管紧张素转换酶抑制剂(Angiotention-Converting Enzyme Inhibitors,ACEI)、血管紧张素受体阻滞剂(Angiotention Receptor Blocker,ARB)、醛固酮受体拮抗剂等药物在临床上的广泛应用,对心肌纤维化的防治也有了很大的进步,但仍需进一步的研究。近年来,随着对转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)/Smads信号通路研究的不断深入,发现TGF-β1/Smads信号通路与心肌纤维化密切相关。TGF-β1/Smads信号通路系统是由TGF-β家族及其受体和Smads蛋白家族组成。在TGF-β家族中TGF-β1是强致纤因子,它可以趋化并诱导心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)分化成肌纤维细胞,后者具有平滑肌细胞和CFs双重功能,能够合成ECM并与TNF-α、TGF-β1等细胞因子发生反应,加速心肌纤维化的进程。另外TGF-β1可以直接刺激胶原蛋白、纤溶酶原激活物抑制剂-1(Plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、蛋白酶组织抑制剂(Tissue inhibitor of metallproteinases,TIMPs)等因子的表达,从而促进ECM的合成并且抑制其降解,进而导致ECM过度沉积,促使心肌纤维化的发生、发展。以TGF-β、Smads蛋白为靶点,阻断TGF-β1/Smads信号通路来进行抗心肌纤维化治疗的研究已成为热点,并取得了一定成绩,但由于TGF-β1/Smads信号通路与多条信号通路存在交叉作用,使得抗TGF-β1/Smads信号通路药物的临床疗效并不确切,甚至出现严重的副作用。丹参酮ⅡA(tanshinoneⅡA,TSNⅡA)是从丹参中提取的脂溶性活性单体,因其具有抗氧化、保护心肌细胞、抗血小板聚集、稳定动脉粥样斑块、扩张冠状动脉等作用而在临床中被广泛用来治疗冠心病、心律失常等心血管疾病。近年来研究发现,TSNⅡA能够通过减少ECM合成,抑制心肌成纤维细胞增殖,达到抗纤维化的作用,但TSNⅡA抗纤维化作用究竟如何,以及其抗纤维化作用机制是否是通过抑制TGF-β1/Smads信号通路来实现的,仍需进一步研究。目的本实验通过皮下植入植入式渗透给药压力泵缓释AngⅡ的方法构建大鼠心脏纤维化模型,给予不同剂量TSNⅡA进行干预,观察大鼠心脏纤维化情况和TGF-β1/Smads信号通路中TGF-β1、p-Smad2/3蛋白及其下游因子CTGF、PAI-1 m RNA和蛋白质水平变化的情况,研究TSNⅡA对AngⅡ所致大鼠心肌纤维化有无拮抗作用;并初步探讨TSNⅡA抗纤维化作用是否与下调TGF-β1/Smads信号通路活性相关,为TSNⅡA抗心肌纤维化的临床应用提供实验依据。材料与方法采用皮下植入植入式渗透给药压力泵缓释AngⅡ的方法建立大鼠心脏纤维化模型。健康SD大鼠32只,体重150~200g,随机取24只制造模型,余8只假手术对照。术后大鼠全部存活,将造模大鼠随机分三组:模型组,给予生理盐水70mg/(kg·d)灌胃;TSNⅡA低剂量组,给予35mg/(kg·d)TSNⅡA灌胃;和TSNⅡA高剂量组,给予70mg/(kg·d)TSNⅡA灌胃(每组8只);对照组给予生理盐水70mg/(kg·d)灌胃。持续灌胃6周后,测体重、心率、尾量法检测各组大鼠尾动脉压。颈椎脱臼法处死大鼠,测左心室质量(left ventricular weight,LVW),并计算左心室质量指数(left ventricular mass index,LVMI);取部分左心室行病理切片Masson染色观察心脏纤维化情况;其余部分于液氮中保存,留做以下实验:化学比色法测定大鼠心肌组织内羟脯氨酸(Hydroxyproline,HYP)含量;实时荧光定量PCR(Real-time PCR,RT-PCR)检测CTGF和PAI-1 m RNA表达水平;Western-blot检测CTGF、PAI-1、TGF-β1和胞内信号蛋白p-Smad2/3的蛋白表达水平。结果(1)大鼠皮下植入植入式渗透给药压力泵缓释AngⅡ2周,灌胃给药持续6周,体重、心率的变化无统计学意义,而血压、LVW、LVMI增加,给予TSNⅡA干预后,大鼠血压变化无统计学意义,而LVW、LVMI较模型组降低,并且高剂量TSNⅡA组LVW、LVMI低于低剂量TSNⅡA组。(2)模型组大鼠心肌组织内HYP含量高于对照组,大鼠心脏切片行Masson染色后显示模型组大鼠心肌纤维化明显,给予TSNⅡA干预后,心肌组织内HYP含量较模型组降低,大鼠纤维化程度较模型组减轻,并且高剂量TSNⅡA组心肌组织内HYP含量低于低剂量TSNⅡA组,心肌纤维化程度较TSNⅡA低剂量组减轻。(3)RT-PCR和Western blot检测结果显示,模型组大鼠心脏组织中PAI-1、CTGF的m RNA、蛋白表达水平和TGF-β1、p-Smad2/3的蛋白表达水平均较对照组增高,给予TSNⅡA干预后,大鼠心脏组织中PAI-1、CTGF的m RNA、蛋白表达水平和TGF-β1、p-Smad2/3的蛋白表达水平较模型组降低,并且TSNⅡA高剂量组大鼠心脏组织中PAI-1、CTGF的m RNA、蛋白表达水平和TGF-β1、p-Smad2/3的蛋白表达水平低于TSNⅡA低剂量组。结论(1)本实验通过皮下植入植入式渗透给药压力泵缓释AngⅡ的方法能够成功制造大鼠心肌纤维化模型,并伴随着血压的升高。(2)缓释AngⅡ模型大鼠心肌组织内促纤因子PAI-1、CTGF高表达,伴随着TGF-β1/Smad2/3信号通路的激活。(3)TSNⅡA能够抑制TGF-β1/Smad2/3信号通路,下调促纤因子PAI-1、CTGF表达,改善AngⅡ诱导的心肌纤维化,并呈剂量依赖性。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R259
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9 胡R
本文编号：2317065
