天麻素治疗非酒精性脂肪性肝病的抗炎和抗氧化机制研究

发布时间：2018-11-09 14:05

【摘要】：非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是由非饮酒因素引起的以肝脏脂肪过量蓄积以及脂肪变性为特点的病理综合征。临床上NAFLD主要表现为肝脏脂肪变性和肝功能损害等。目前,临床上还没有任何一种NAFLD的单一药物治疗方法获得批准。随着全球肥胖人数的增多,近年来AFLD患者的数量也显著增多。因此研制出有效的治疗NAFLD的药物成为了一个亟待解决的问题。天麻是一种历史悠久的传统中药,具有治疗头痛、肢体麻木、惊厥等药理作用。天麻素(GSTD,分子量：295.3)是天麻的主要有效成分,目前临床上主要用于治疗神经系统疾病。我们研究团队在前期研究中发现GSTD通过激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)来抑制油酸(OA)诱导的肝细胞脂肪变性,而天麻粉可显著缓解饮食诱导的大鼠肝脏脂肪变性。另外有研究报道,GSTD在神经细胞和心肌细胞中有显著的抗炎和抗氧化作用。NAFLD的发生和发展与氧化应激、炎症反应有密切的关系。因此,我们接下来研究GSTD在治疗NAFLD的过程中的抗炎和抗氧化作用,并探索其可能相关的信号通路。在体外实验中,将HL-7702细胞进行24 h的血清饥饿后,用0.6 mmol/L的OA处理24 h形成脂肪变性模型,同时加GSTD处理细胞。以特异性siRNA转染细胞以沉默靶基因的表达；以compound C (10μmol/L)预处理细胞1 h,进行信号通路的阻断实验。细胞处理完成后,提取蛋白以及总RNA,用于western blot、实时定量反转录-PCR (RT-PCR)检测,同时进行氧化应激和炎症反应相关指标的检测。小鼠实验中一部分雄性C57BL/6小鼠给予正常饲料作为空白对照组,其余小鼠给予高脂饲料(HFD)(含60 kcal%脂肪,20 kcal%蛋白质,20 kcal%碳水化合物)。给予HFD的小鼠被分为4组,其中一组作为模型对照组,其余小鼠在投喂HFD的同时灌胃给予10 mg/kg、20 mg/kg或50 mg/kg的GSTD。连续给药10周,在此期间,一周记录两次体重以及摄食量。实验结束时禁食12h后眼眶取血,测定血清胆固醇(CHO)、三酰甘油(TG)、葡萄糖、胰岛素,并取肝脏和脂肪等组织称重,检测相关指标。在大鼠模型的实验中,采用雄性SD大鼠,一部分大鼠给予正常饲料,其余大鼠以高脂高胆固醇(HFHC)饲料(含10%猪油,0.5%胆固醇、0.1%胆酸盐、89.4%常规饲料)进行喂养,8周以后一部分大鼠不予处理,其余灌胃给予GSTD,剂量为20 mg/kg或50 mg/kg共10周。实验期间一周记录两次体重以及摄食量。在实验的开始、第8周末及实验结束时禁食12h后眼眶取血, 测定血清CHO、TG、葡萄糖、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)。实验结束后处死动物,取出肝脏称重并检测相关指标。体外结果发现,OA能诱导HL-7702细胞的氧化应激和炎症反应,而GSTD能显著增加HL-7702细胞中超氧化物歧化酶(SOD)的活性,减少活性氧自由基(ROS)和丙二醛(MDA)的生成,同时下调促炎性细胞因子如肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白介素-6(IL-6)和环氧化酶2(COX2)的mRNA表达水平。在HL-7702细胞中GSTD能促进红系衍生核因子相关因子2(Nrf2)的丝氨酸40位点(Ser40)的磷酸化并增加其细胞核转位,从而刺激抗氧化反应元件(ARE)的转录活性并上调血红素加氧酶-1(HO-1)的表达。另外GSTD能通过激活肝激酶B1 (LKB1)来激活AMPK。Nrf2 siRNA能完全阻断GSTD增加Nrf2核转位、刺激ARE转录以及上调HO-1表达的作用。GSTD对OA诱导的氧化应激和炎症反应的抑制作用也被Nrf2siRNA所完全阻断。另外,GSTD激活MPK/Nrf2/HO-1通路的作用及其抗炎抗氧化活性能被AMPK的特异性抑制剂compound C所完全阻断。在大鼠和小鼠的NAFLD模型中,GSTD能够显著抑制肝脏脂肪变性和炎细胞浸润,减少肝脏TG蓄积、肝脏重量和肝指数,降低血清中TG、葡萄糖、胰岛素、ALT和AST水平,减少模型动物体重的增加和附睾脂肪重量。GSTD还能显著增加肝脏SOD活性,减少MDA浓度,并下调TNF-α、IL-6和COX2等促炎性细胞因子的表达。同时,GSTD显著激活肝脏AMPK/Nrf2/HO-1通路,上调HO-1的表达。综上所述,本研究发现GSTD能够通过激活肝脏的AMPK/Nrf2信号通路来上调HO-1的表达,从而缓解NALFD中的氧化应激和炎症反应,并同时促进肝脏脂类代谢。因此,将来GSTD有望开发成为治疗NAFLD的新型临床药物。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R259

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