【摘要】：目的:壮药妇雅净颗粒为本项目组前期研制的新制剂,前期研究发现该颗粒对大鼠盆腔炎性疾病后遗症(sequelae of PID)治疗效果好,能改善混合菌感染加机械损伤法建立的大鼠sequelae of PID症状,但其作用机制不明。本研究采用混合菌感染加机械损伤法建立可靠的sequelae of PID大鼠模型,给予相应量的壮药妇雅净颗粒治疗,通过检测对TNF-α、TL-10、NO、NOS、SOD、MDA、ICAM-1、NF-κB、NF-κBm RNA和ICAM-1 m RNA表达的影响,探讨其对NF-κB信号通路的干预机制,为壮药妇雅净颗粒治疗盆腔炎性疾病后遗症的临床治疗提供实验依据。方法:(1)壮药妇雅净颗粒的制备:按壮药妇雅净处方比例称取药材10Kg,加10倍60%乙醇回流提取2次,每次2小时,300目滤布过滤,滤液浓缩至稠浸膏,测定稠浸膏含固量,加入适量可溶性淀粉搅拌均匀,使每g理论干膏含原药材2.33g,14-16目筛制粒,80℃鼓风干燥,14目筛整粒,按得膏率21%算,10kg应得浸膏2.1kg,按干膏含原药量为2.33g药材/g,应加辅料2.19kg。之后按每袋12g分装,相当于含原药材28g/袋。(2)建模:建立以混合菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以1:1的比例溶于无菌生理盐水配成浓度为3×109个/m L的混合细菌悬液)加机械损伤制造的大鼠盆腔炎性疾病后遗症模型组,大鼠腹腔打开不做任何处理随机关腹缝合作为假手术组。在建模后第1d、3d、5d、7d、14d、21d、28d取模型组、假手术组和空白对照组大鼠的全血、子宫做相应的血常规及病理切片。通过检测的血常规及病理切片评判的统计分数来确定在造模后第几天形成盆腔炎性疾病后遗症症模型。(3)取材、处理:大鼠建成盆腔炎性疾病后遗症模型后,随机分组:空白对照组、假手术组、模型组、花红颗粒阳性组、地塞米松阳性组、壮药妇雅净颗粒高、中、低剂量组。建模后每隔一天给大鼠称重,并给予15d的相应药物治疗及纯水灌胃。在第15d灌胃1h后,将大鼠麻醉,取大鼠胸腺、脾脏、子宫称重,并计算脏器系数值;全血一部分做血液流变学及血常规,另一部分静置离心取血清待测;将取出的子宫组织分为三部分:一部分用4%多聚甲醛浸泡,用于做病理切片和免疫组化;一部分取出后加一定体积的生理盐水匀浆,取上清液备用;最后一部分迅速放入液氮中速冻,再放入-80℃冻存备用。(4)采用WST-1法检测sequelae of PID大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活力,TBA法检测血清中丙二醛(MDA)含量,硝酸还原酶法检测血清中一氧化氮(NO)含量,用化学比色法测定一氧化氮合酶(NOS)活力。(5)采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测sequelae of PID大鼠子宫组织液中IL-10、TNF-α含量。(6)免疫组化法检测sequelae of PID大鼠子宫组织核因子-κB(NF-κB)和细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的表达。(7)逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测sequelae of PID大鼠子宫组织核因子-κB信使RNA(NF-κBm RNA)和细胞间粘附分子-1信使RNA(ICAM-1 m RNA)表达。结果:(1)制得的壮药妇雅净颗粒呈棕黄色味微苦,按12g/袋分装,批号为:20150726,存放于干燥器中,备用。(2)造模第14d模型组血液中白细胞数显著升高(P0.01),中性粒细胞数显著升高(P0.05),淋巴细胞显著下降(P0.05)。病理HE染色切片观察到,第14d宫腔扩张、腔壁结构改变,存在炎症细胞浸润。建模后大鼠体重急剧下降,在第五天左右开始恢复体重,给药14天后,模型组子宫脏体比值较大但不显著(P0.05),而胸腺比值、脾脏比值显著较小(P0.01);模型组血常规中白细胞数显著升高(P0.01),中性粒细胞数显著升高(P0.01),淋巴细胞数显著降低(P0.01),模型组子宫解剖形态学综合评分显著升高(P0.05)。表明造模后第14天形成盆腔炎性疾病后遗症症模型。(3)与空白对照组相比,模型组大鼠血清中SOD活力显著下降(P0.01),血清中MDA含量、NO含量、NOS活力显著升高(P0.05,P0.01,P0.05)。与模型组相比,壮药妇雅净颗粒组SOD活力显著升高(P0.01);MDA含量显著降低(P0.05);NO含量及NOS活力显著降低(P0.01)。(4)与空白对照组比较,模型组大鼠子宫组织液中IL-10、TNF-α的浓度显著升高(P0.01)。与模型组比较,壮药妇雅净颗粒组IL-10、TNF-α的浓度显著降低(P0.01)。(5)与空白对照比较,模型组大鼠子宫组织NF-κB、ICAM-1免疫组化表达显著升高(P0.01)。与模型组比较,壮药妇雅净颗粒组大鼠子宫组织NF-κB的表达显著降低(P0.01);壮药妇雅净颗粒高剂量组(P0.01)、中和低剂量组(P0.05)大鼠子宫组织ICAM-1的表达显著降低。(6)与空白对照组比较,模型组大鼠子宫组织NF-κBm RNA和ICAM-1m RNA的表达显著升高(P0.05);与模型组比较,壮药妇雅净颗粒组大鼠子宫组织NF-κBm RNA、ICAM-1m RNA的表达显著降低(P0.05)。结论:(1)壮药妇雅净颗粒新制剂的制备工艺简单易行,有利于将来工业化生产。(2)本实验混合菌加机械损伤法建立盆腔炎性疾病后遗症动物模型形成的初始时间为造模后第14d。(3)壮药妇雅净颗粒对盆腔炎性疾病后遗症大鼠NF-κB信号通路的干预机制为:上调大鼠体内的抗炎因子SOD活力的水平,下调节炎症因子MDA、NO、NOS,IL-10、TNF-α、NF-κB、ICAM-1、NF-κBm RNA、ICAM-1m RNA的水平,从而改善盆腔炎性疾病后遗症的症状。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：广西中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R29
【参考文献】
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2331663
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