头花蓼对幽门螺杆菌相关性胃炎模式识别受体及胃肠激素的影响

发布时间：2018-11-23 11:11

【摘要】：目的:本实验通过检测H.pylori感染以及头花蓼治疗后SD大鼠固有免疫应答中重要的模式识别分子TLR4和DC-SIGN的蛋白和基因水平,以及胃肠激素GAS、SS m RNA表达变化,探讨头花蓼抗H.pylori可能的机制和调节和修复的作用,为临床研究治疗H.pylori感染的慢性胃炎及新药的研发提供有价值的实验依据。方法:(1)H.pylori SS2000的培养:将SS2000均匀涂布于哥伦比亚血琼脂上,37℃三气培养箱内培养72h,观察细菌生长情况,稳定传代3次后进行H.pylori鉴定;(2)建立H.pylori感染SD大鼠的慢性胃炎动物模型:SD大鼠适应性饲养1w后,将96只SPF级SD大鼠随机分为模型组(70只)、空白组(16只)以及药物空白组(16只),所有SD大鼠禁食不禁水12h,5g/L的Na HCO3和消炎痛混合液进行预处理,雄鼠1.0m L/只,雌鼠0.5m L/只;灌胃后继续禁食不禁水,6h后模型组给予1×109cfu/m L H.pylori SS2000菌液1.5m L,灌胃后禁食禁水4h,隔天灌胃,共5次,空白组及药物空白组以等量的无菌脑心浸液肉汤代替;(3)感染动物模型鉴定:末次灌胃结束后8w,禁食禁水24h,模型组及空白组随机抽取6只SD大鼠进行处死,按照洛桑标准,将胃窦黏膜进行HE染色,观察SD大鼠胃黏膜发生慢性炎症改变;对SD大鼠胃黏膜进行快速尿素酶实验、细菌微需氧培养及改良W-S银染法检测胃黏膜H.pylori的定植。模型组SD大鼠胃黏膜呈现慢性炎症病理改变并有H.pylori定植,证实慢性胃炎动物模型构建成功;(4)药物治疗:成功造模后,将造模组分为4组(16只/组)分别进行头花蓼高、中、低剂量药物连续治疗2w,模型组不予治疗。药物空白组以高剂量头花蓼给正常SD大鼠,空白组正常饲养。末次灌胃2w后,处死SD大鼠取其胃组织(处死前禁食禁水24h),取出胃黏膜组织胃窦部分,将其分为4份,一份装入脑心浸液肉汤保存液中,进行H.pylori微需氧培养;一份进行快速尿素酶实验(试纸法);一份装入样品保护液中,冻存于-80℃的冰箱中,用于RNA提取;一份放入配好的福尔马林固定液中,进行组织切片,用于HE染色、免疫组化等;(5)头花蓼效果评价:H.pylori的清除率;HE染色观察胃黏膜淋巴细胞浸润情况;(6)以头花蓼效果最好的剂量作为治疗组,采用免疫组化和real-time PCR的方法检测头花蓼治疗前后SD大鼠固有免疫应答中重要模式识别分子DC-SIGN、TLR4的蛋白和基因水平表达变化;(7)采用原位杂交法检测GAS(Gastrin,Gas)、SS(Somatostatin,SS)的m RNA的表达变化。结果:(1)H.pylori SS2000鉴定:尿素酶、触酶、氧化酶、革兰染色观察证实确为H.pylori SS2000;(2)接种H.pylori后8w,经模型鉴定,HE染色结果显示模型组SD大鼠胃黏膜均呈现慢性炎症改变,胃黏膜H.pylori培养、胃黏膜快速尿素酶阳性、Giemsa染色有H.pylori定植,证实H.pylori感染SD大鼠慢性胃炎的动物模型构建成功;(3)头花蓼治疗效果:经SD大鼠胃黏膜H.pylori培养结果显示,头花蓼药物不同剂量作用以后,H.pylori的定植密度有不同程度的降低,头花蓼高剂量组(172.29mg浸膏/m L)清除率为91.573%,头花蓼中剂量组(57.43mg浸膏/m L)清除率为78.200%,头花蓼低剂量组(19.14mg浸膏/m L)清除率为76.327%;头花蓼不同剂量对胃黏膜的炎症改善情况有所不同;(4)免疫组化结果显示,TLR4、DC-SIGN主要在胃黏膜上皮细胞胞浆中表达,在空白组中,上皮细胞构成规则的腺体,未见表达,模型组中,TLR4、DC-SIGN表达强阳性,H.pylori上调了TLR4、DC-SIGN的表达水平,分别上调1.6倍和3.2倍(P0.01),经头花蓼治疗后的,阳性表达减弱,分别下调了1.33倍和2.6倍(P0.01),头花蓼空白组与空白组相比较,无统计学意义,P0.05;(5)real-time PCR结果显示:H.pylori刺激后,模型组的TLR4 m RNA和DC-SIGN m RNA表达量明显上调,分别是2.7倍和3倍(P0.05),经头花蓼作用后,TLR4m RNA与DC-SIGN m RNA的表达水平有明显的下调趋势(P0.05),分别为1.97倍和1.76倍,空白组与药物空白组无统计学差异;(6)原位杂交显示:感染H.pylori后GAS表达明显升高,阳性表达较空白组多,通过扫描灰度值计算GAS光密度值显示上调1.26倍(P0.01),SS表达明显下降,光密度值明显下调1.19倍(P0.01),头花蓼作用后GAS下调1.12倍(P0.05);SS表达有轻微程度的升高,但不明显(P0.05)。结论:(1)头花蓼高剂量对H.pylori清除效果最好,且改善胃黏膜炎症效果良好;(2)头花蓼可能通过调节模式识别受体TLR、DC-SIGN来影响固有免疫平衡;(3)头花蓼可能具有调节胃肠激素GAS、SS平衡的功能。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R259

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本文编号：2351380