MAPKs信号转导通路在天然冰片调控体外BTB通透性中的作用

发布时间：2019-01-04 22:07

【摘要】：目的：通过建立体外血肿瘤屏障模型(blood-tumor barrier, BTB),研究天然冰片通过MAPKs信号转导通路开放血肿瘤屏障的分子机制以及对BTB模型上紧密连接蛋白的调控作用；阐明天然冰片调节血肿瘤屏障开放的效果和机制,诠释其“芳香开窍、引药上行”的科学内涵,也为临床上神经胶质瘤等颅内疾病的治疗开辟一条新的途径。方法：1.体外BTB细胞模型的建立。大鼠C6胶质瘤细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)非接触共培养建立体外BTB细胞模型。2.天然冰片对血肿瘤屏障模型通透性的影响实验分4组：空白对照组、冰片低剂量组(25μg/mL)、冰片中剂量组(50μg/mL)、冰片高剂量组(100μg/mL),每组3个复孔。跨细胞阻值和HRP流量测定不同剂量天然冰片对BTB通透性的影响。3.天然冰片对MAPKs信号转导通路相关激酶表达的影响。实验分4组：空白对照组、冰片低剂量组(25μg/mL)、冰片中剂量组(50μg/mL)、冰片高剂量组(100μg/mL),每组3个复孔。Western blot柃测不同剂量的天然冰片对MAPKs通路相关激酶JNK、ERK、p38及其磷酸(p-JNK、p-ERK、和p-p38)表达的影响。4.天然冰片和U0126合用对紧密连接相关蛋白、基因的表达及血肿瘤屏障通透性的影响。选择ERK信号通路特异性抑制剂U0126,实验分8组：空白对照组、冰片低剂量组(25μg/mL)、冰片中剂量组(50μg/mL)、冰片高剂量组(100μg/mL)、U0126组、U0126+冰片低剂量组、U0126+冰片中剂量组、U0126+冰片高剂量组,每组3个复孔。跨细胞阻值和HRP流量测定不同组别的BTB通透性；Western blot检测不同组别激酶ERK和p--ERK以及紧密连接相关蛋白Claudin-5、F-actin和ZO-1的表达;RT-PCR检测不同组别紧密连接相关基因Claudin-5、F-actin和ZO-1的表达。5.冰片和Sorafenib Tosylate (ST)合用紧密连接相关蛋白、基因的表达及血肿瘤屏障通透性的影响。本实验进一步对RAF/MEK/ERK信号通路的上游RAF位点进行研究。选择Raf特异性抑制剂ST,实验分8组：空白对照组、冰片低剂量组(25μg/mL)、冰片中剂量组(50μg/mL)、冰片高剂量组(100μg/mL)、ST组、ST+冰片低剂量组、ST+冰片中剂量组、ST+冰片高剂量组,每组3个复孔。跨细胞阻值和HRP流量测定各组别的BTB通透性；Western blot检测各组别激酶Rafl和p-Raf1以及紧密连接相关蛋白Claudin-5、F-actin口ZO-1的表达；RT-PCR检测各组别紧密连接相关基因Claudin-5、 F-actin和Z0-1的表达。结果：1.成功建立了体外BTB细胞模型,可模拟体内血肿瘤屏障环境,用于药物跨血肿瘤屏障特性方面的研究。2.跨细胞阻值测定天然冰片对BTB细胞模型通透性的影响,结果显示：与空白对照组相比,天然冰片低、中、高剂量组(25、50、100μg/mL)的细胞电阻值均随着作用时间的延长先逐渐降低,各组均在30min降低最明显,120-240min时逐渐恢复正常水平。同一时间点电阻值的变化呈现剂量依赖趋势(P0.01)。HRP流量测定天然冰片对BTB细胞模型通透性的影响,结果显示：与空白对照组相比,天然冰片低、中、高(25、50、100μg/mL)的HRP通透率均随着作用时间的延长逐渐提高,具有统计学意义(P0.01)；且同一时间点HRP通透率的提高呈现剂量依赖趋势,具有统计学意义(P0.01)。从相邻时间点的透过率差值分析,低、中、高剂量组均在10-30min、 30-60min时,HRP透过率提升最明显,60-120min时通透率增加幅度降低,120-240min时,通透率恢复正常水平。3. Western blot检测天然冰片对MAPKs信号通路激酶ERK、p-ERK、p38、p-p38. JNK、p-JNK表达的影响,结果显示：ERK蛋白在不同时间点间及不同组别间没有显著性的变化,p-ERK蛋白的表达量随作用时间的延长先升高,然后又逐渐恢复至药前水平,30mi n时表达量最高,并且存在剂量依赖性(p0.05; p38蛋白在不同时间点间及不同组别间没有显著性的变化；JNK蛋白在不同时间点间及不同组别间没有显著性的变化,p-JNK蛋白表达在120min内无明显变化,180-240min开始明显降低,且存在一定的剂量依赖趋势(p0.05)。4.细胞电阻值测定结果显示：与空白对照组相比,U0126组的细胞电阻值明显升高,冰片组的细胞电阻值降低,差异具有具有统计学差异(p0.01);与冰片组相比,U0126合用组的细胞阻值明显升高(p0.05)。HRP流量测定结果显示：与空白对照组相比,U0126组的HRP通透率明显降低,冰片各组的HRP通透率明显增加,差异具有统计学差异(p0.01)；与冰片组相比,U0126合用组的HRP通透率明显降低(p0.05)。Western blot测定ERK、p-ERK蛋白表达,结果显示：与空白对照组相比, U0126组的p-ERK表达明显降低(p0.01),冰片各组的ERK、p-ERK表达明显升高(p0.01)；与冰片组相比,U0126合用组的ERK、p-ERK表达明显降低(p0.05)；Western blot测定Claudin、Z0-1、F-actin蛋白表达,结果显示：与空白对照组相比,U0126组的Claudin-5、-Z0-1、F-actin的蛋白表达明显升高,冰片组的Claudin-5、Z0-1、 F-actin的蛋白表达明显降低,差异具有统计学差异(p0.01);与冰片组相比,U0126合用组的Claudin-5、Z0-1、F-actin的蛋白表达均明显升高(p0.05)。RT-PCR测定Claudin-5、Z0-1、F-actin的基因表达变化,结果显示：与空白对照组相比,U0126组的Claudin-5、Z0-1、F-actin基因表达明显升高,冰片组的Claudin-5、Z0-1、 F-actin基因表达明显降低,差异具有统计学差异(p0.01);与冰片组相比,U0126合用组的Claudin-5、Z0-1、F-actin的基因表达均明显升高,与蛋白变化结果一致。5.跨细胞电阻值测定结果显示：与空白对照组相比,ST组的细胞电阻值明显升高,冰片组的细胞电阻值明显降低,差异具有统计学差异(p0.01);与冰片组相比,ST合用组的细胞电阻值明显升高(p0.05)。HRP流量测定结果显示：与空白对照组相比,ST组的HRP通透率明显降低,冰片组的HRP通透率明显提高,差异具有统计学差异(p0.01);与冰片组相比,ST合用组的通透率明显降低(p0.05)。Western blot方法测定Raf1、p-Raf1的蛋白表达,结果显示：与空白对照组相比,ST组的Raf1、p-Raf1表达明显降低,冰片组的Raf1、p-Raf1表达明显增加,差异具有统计学差异(p0.01)；与冰片组相比,ST合用组的Raf1与p-Raf1表达明显降低(p0.05)。Western blot方法测定紧密连接蛋白Claudin-5、Z0-1、F-actin的蛋白表达,结果显示：与空白对照组相比,ST组蛋白Claudin-5、Z0-1、F-actin的表达明显升高,冰片组的Claudin-5、Z0-1、F-actin的表达明显减少,差异具有统计学差异(p0.01)；与冰片组相比,ST合用组的Claudin-5、Z0-1、F-actin的蛋白表达均明显升高(p0.05)、RT-PCR测定Claudin-5、Z0-1、F-actin的基因表达,结果显示：与空白对照组相比,ST组的Claudin-5、Z0-1、F-actin基因表达明显升高,冰片组的Claudin-5、Z0-1、F-actin基因表达明显降低,差异具有统计学差异(p0.01)；与冰片组相比,ST合用组的Claudin-5、Z0-1、F-actin的基因表达均明显升高,趋势与蛋白变化一致。结论：天然冰片通过激活RAF/MEK/ERK/MAPKs信号转导通路,进而调控下游相关紧密连接蛋白Claudin-5、Z0-1、F-actin的基因、蛋白表达和和分布,从而调节BTB的通透性。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R273

【相似文献】