破痞去滞蒙药特穆日—敖日阳古生物活性成分及抗肿瘤机制研究

发布时间：2019-03-27 10:10

【摘要】：蒙药材特穆日-敖日阳古为毛茛科铁线莲属植物芹叶铁线莲(Clematis aethusifolia Turcz.)的干燥带花叶枝条,是蒙医常用的破痞去滞药,《卫生部药品标准》(蒙药分册)收载。具破痞,燥“协日乌素”,止腐,消肿,止泻之功效,常用于治疗各种寒痞、食积、水肿、创疡、痔疮等,现代临床用于治疗各种肿瘤,包括癌症。目的通过对蒙药特穆日-敖日阳古抗肿瘤活性部位和成分的研究,寻找蒙药破痞去滞功效与抗肿瘤活性之间的内在联系,用现代医学理论阐释特穆日-敖日阳古破痞去滞功效的物质基础及作用机理,为传统蒙药临床合理用药提供新思路。方法及结果(1)化学成分分离及鉴定:采用Sephadex LH-20、大孔树脂、反相C_(18)柱色谱和制备高效液相等方法,对蒙药特穆日-敖日阳古的醇提物进行分离纯化,并运用1D,2D-NMR,HRMS等波谱分析法和文献对照法鉴定化合物结构。从特穆日-敖日阳古的正丁醇及乙酸乙酯萃取层分离得到15个化合物,分别为(3R)-6,7,8-trimethoxy-2,3,4,5-tetrahydrobenz-1-oxepin-3-ol(1),3-O-p-coumaroyl-2-C-methyl-D-erythrono-1,4-lactone(2),4-O-caffeoyl-2-C-methyl-D-erythrono acid(3),4-O-Caffeoyl-2-C-methyl-D-erythrono-1,4-lactone(4),(-)-4-(3,4-dihydroxyphenyl)-5-hydroxy-2(5H)-furanone(5),咖啡酸(6),1-O-咖啡酰基-α-D-吡喃葡萄糖苷(7),苯基-a-L-呋喃阿拉伯糖(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(8),七叶内酯(9),东莨菪内酯(10),芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(11),3'-氧甲基-芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(12),香草酸(13),原儿茶酸(14),正丁基-β-D-呋喃果糖苷(15)。(2)细胞毒活性检测:采用CCK-8细胞染色法检测课题组分离得到的从特穆日-敖日阳古中的38个单体化合物对5株常见人体实体瘤细胞系(人肺癌细胞系A549、人卵巢癌细胞系SK-OV-3、人黑色素瘤细胞系A-375、人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y和人结直肠腺癌细胞系HCT-15)的生长抑制作用。其中1-O-咖啡酰基-α-D-吡喃葡萄糖苷(7)、七叶内酯(9)、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(11)、3'-氧甲基-芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(12)和芹菜素(16)对部分肿瘤细胞系有显著的细胞毒活性,IC_(50)值范围在15-60μM之间,其余化合物对所测试的五种癌细胞系均无明显细胞毒活性,IC_(50)值100μM。(3)计算机肿瘤靶标数据库靶点筛选:通过DellPower Edge R900分子模拟服务器将特穆日-敖日阳古中分离得到的单体化合物上传,使用Auto Dock程序进行对14种临床常见肿瘤靶标进行分子对接,筛选出具有活性抑制作用的癌症相关靶标。通过靶点分子对接得知从特穆日-敖日阳古分离得到的单体化合物大部分对肿瘤细胞内信号通路蛋白激酶BRAF和PI3K抑制作用较强。(4)抗肿瘤机制研究:采用荧光定量PCR法,检测单体化合物七叶内酯、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素刺激肿瘤细胞后PI3K-AKT-m TOR和RAS-RAF-MEK信号通路上相关基因ERK_2、RAF、PDK_1和AKT的m RNA变化,结果显示用七叶内酯处理肿瘤细胞后,A-375细胞内ERK_2基因的m RNA表达量显著降低,其他检测基因的m RNA表达量无变化;SH-SY5Y细胞内PDK_1基因的m RNA表达量显著降低,其他基因的m RNA表达量无变化。用芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷处理肿瘤细胞后,A-375细胞内四种检测基因的m RNA表达量均无变化;SH-SY5Y细胞内PDK_1基因的m RNA表达量显著降低,其他基因的m RNA表达量无变化。用芹菜素处理肿瘤细胞后,A-375细胞内ERK_2基因的m RNA表达量显著降低,其他检测基因的m RNA表达量无变化;SH-SY5Y细胞内ERK_2、PDK_1和AKT基因的m RNA表达量显著降低,其他检测基因的m RNA表达量无变化。采用Western blot检测单体化合物七叶内酯、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素刺激肿瘤细胞后PI3K-AKT-m TOR及RAS-RAF-MEK信号通路上相关蛋白phospho-AKT、AKT、phospho-PDK1、PDK1、phospho-ERK(1/2)和ERK(1/2)表达的变化。结果显示用七叶内酯处理肿瘤细胞后,A-375细胞内六种检测蛋白的表达量均无变化;SH-SY5Y细胞内phospho-AKT、AKT和phospho-PDK1蛋白表达量显著降低,其他检测的蛋白表达量无变化。用芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷处理肿瘤细胞后,A-375细胞内phospho-AKT、AKT、PDK1、phospho-ERK(1/2)和ERK(1/2)的蛋白表达量显著降低,其他检测的蛋白表达量无变化;SH-SY5Y细胞内AKT蛋白表达量显著降低,其他检测的蛋白表达量无变化。用芹菜素处理肿瘤细胞后,A-375细胞内phospho-AKT、AKT、phospho-PDK1、PDK1、phospho-ERK(1/2)和ERK(1/2)的蛋白表达量均显著降低;SH-SY5Y细胞内phospho-PDK1、PDK1和phospho-ERK(1/2)蛋白表达量显著降低,其他检测的蛋白表达量无变化。结论化合物1 15均从特穆日-敖日阳古中首次分离得到,其中化合物1 3为新化合物,4,5,8,15为毛茛科内首次分离,7,9,12为铁线莲属内首次分离;细胞毒活性检测与抗肿瘤机制研究结果提示七叶内酯(9)、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(11)和芹菜素(16)具有抗肿瘤活性,并通过PI3K-AKT-m TOR和/或RAS-RAF-MEK信号通路抑制肿瘤细胞生长。
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【学位授予单位】：内蒙古医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R29

【参考文献】