红花提取物对大鼠肝硬化的抑制作用及其机制研究
发布时间：2019-07-29 15:04
【摘要】：背景：肝硬化(hepatic sclerosis)是一种较常见的慢性肝病,其病理病因复杂且具有长期反复的特征,对肝脏造成极大的损伤。在病理组织学上可见：肝组织细胞出现大量的坏死、肝细胞出现结节性再生、肝脏内出现增生和纤维性结节、肝小叶结构出现明显破坏并出现假小叶的形成、肝脏逐渐变硬最后发展为肝硬化丧失正常的肝组织功能。在肝相关指标上可见：肝硬化早期血、尿常规并无异常,肝硬化症状较明显的中期开始出现血清中的丙氨酸转氨酶(alaninetransaminase, ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、球蛋白等含量升高以及前白蛋白、白蛋白和凝血功能下降等。肝硬化的临床上主要表现在肝功能的损伤,且严重时累及其他脏器组织,肝硬化晚期常伴随出现门静脉高压、脾功能亢进、脑组织损伤、消化系统出血等并发症[2]。目前的研究认为,肝硬化的致病机制主要有肝成纤维细胞和肝星型细胞的增殖与迁移,炎症引起的氧化应激,以及肝细胞凋亡等。近年来,肝硬化的发病率日益升高,而因其病理病因较复杂,使得目前对其发病机制及治疗干预方法依然不甚明了,已经成为备受关注的社会健康问题。红花为菊科植物,含红花黄色素和红花苷,红花苷经盐酸水解后,可以得葡萄糖和红花素；还含15a,20β-二羟基-△4-娠烯-3-酮；除此之外还含有脂肪油称红花油,是棕榈酸、花生酸、硬脂酸、亚麻酸、油酸、亚油酸等的甘油酯类。红花性味辛、温,归心、肝经,有抗凝血、抗血栓形成、增加冠状动脉血流量和降低冠状动脉阻力、扩张血管、改善微循环,降低血压及调节血脂、抗炎、镇痛、抗氧化、保肝、免疫调节及抗肿瘤等作用[7-9]。中医专家常以联合用药的方式将红花用于慢性肝病或肝硬化的治疗,然而其对肝硬化的抑制作用机制仍不为人知。本课题以二乙基亚硝胺诱导大鼠肝硬化为模型,拟验证红花提取物(Carthamus tinctorius L. extract, CTLE)对肝硬化的抑制作用,并将初步探讨其作用机制。目的：通过建立二乙基亚硝胺(Diethyl nitrosamine, DEN)诱导大鼠肝硬化模型,探讨红花提取物对肝硬化的抑制作用及其作用机制。为临床上应用红花提取物治疗肝硬化提供理论基础。方法：1.二乙基亚硝胺诱导大鼠肝硬化模型：取30只健康大鼠随机分为三组,每组10只。第一组为正常组,每周腹腔注射一次生理盐水,每日口服生理盐水(SI),量同实验组,处理8周；第二组为二乙基亚硝胺诱导大鼠肝硬化模型(对照组),每周腹腔注射一次70 mg/2 mL/kg浓度的二乙基亚硝胺(DEN),每日口服生理盐水,处理8周；第三组为二乙基亚硝胺诱导大鼠肝硬化模型(实验组),每周腹腔注射一次70 mg/2 mL/kg浓度的二乙基亚硝胺(DEN),每日口服40mg/10 mL/kg浓度的红花提取物(CTLE),处理8周。分别于处理的第0周、第4周和第8周进行眶下窦取血,在第8周处死大鼠并取大鼠肝组织、线粒体等进行后续检测、对比和分析。2.每组大鼠的肝组织,经固定、石蜡包埋、切片获得组织切片,采用马松三色染色法观察组织形态学结构变化。3.分光光度法检测大鼠血浆中丙氨酸转氨酶及天冬氨酸转氨酶的含量。4.采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法测定各组大鼠血浆中肿瘤坏死因子-a (Tumor necrosis factor-a, TNF-a)、转化生长因子-β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1)的浓度。5.差速离心法分离肝组织细胞线粒体及胞浆。6.透射电镜观察肝细胞线粒体形态学改变。7.采用比色法检测肝组织和线粒体中的丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物酶(Superoxide dismutase, SOD)的含量,观察肝组织及线粒体氧化反应程度。8.采用分光光度法检测线粒体膜势能以及线粒体中ATP的变化,Clark氧电极法检测线粒体呼吸功能,观察线粒体损伤情况。9.肝组织切片进行TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)染色,观察细胞凋亡情况。10.蛋白质印迹法(Western Blot)检测多个组织中细胞色素C、Bax、 Pro-caspase9和caspase3的蛋白含量。结果：1、红花提取物对肝硬化模型大鼠肝组织保护作用(1)组织形态学结果显示,红花提取物处理的组较对照组由大鼠肝硬化引起的肝组织损伤明显减轻,可见组织形态相对完整、组织细胞凋亡坏死减少、且炎性细胞浸润明显减轻、肝细胞肿大减轻、肝组织纤维化减轻等。(2)我们发现红花提取物能明显降低大鼠肝硬化引起的血浆中丙氨酸转氨酶及天冬氨酸转氨酶的升高。(3)红花提取物能明显降低大鼠肝硬化引起的血浆中肿瘤坏死因子TNF-α、转化生长因子TGF-β1的浓度的升高。(4)肝硬化大鼠肝组织中MDA水平明显升高,而SOD的含量明显下降,说明肝硬化的大鼠肝组织中氧化应激明显增强；红花提取物处理则能明显降低MDA的水平,并提高SOD的含量。说明红花提取物可以有效抑制大鼠肝硬化引起的肝组织氧化应激。2、红花提取物对肝硬化大鼠肝线粒体的影响。(1)通过使用透射电镜对肝组织线粒体进行观察,我们发现,空白组大鼠肝线粒体排列整齐、形态正常；对照组的大鼠线粒体肿胀且形态不规则,边界不清晰,且大小不一致；而实验组线粒体的肿胀、结构不清晰、大小不一等情况有明显改善。(2)肝硬化大鼠的线粒体膜势能相比空白组大幅度降低,而红花提取物处理组线粒体膜势能高于对照组。这说明红花提取物处理可以帮助线粒体维持其膜势能,维持线粒体渗透压平衡,保护线粒体的结构免受损伤。3、红花提取物对肝硬化大鼠肝线粒体功能的影响。(1)肝硬化大鼠肝细胞线粒体中MDA的水平明显升高,而SOD的含量明显下降,说明肝硬化的大鼠肝组织细胞线粒体中氧化应激明显增强；红花提取物处理则能明显降低线粒体MDA的水平,并提高SOD的含量。说明红花提取物可以有效抑制大鼠肝硬化引起的肝组织细胞线粒体的氧化应激。(2)大鼠由于肝硬化可增强肝细胞线粒体中三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)的消耗,增强线粒体的氧化反应程度,而红花提取物组大鼠线粒体中ATP的消耗明显低于对照组。与之一致的是,红花提取物组大鼠线粒体中的磷氧比明显高于对照组。4、红花提取物对肝硬化大鼠肝组织细胞凋亡的影响(1)TUNEL染色结果显示,空白组凋亡细胞较少,而相较于空白组,对照组大鼠肝组织细胞凋亡明显增加,而红花提取物处理的实验组相较于对照组凋亡明显下降。(2)空白组中,Bax的表达以在细胞质基质为主,而对照组中Bax的表达在线粒体中显著增强,在细胞质基质中表达显著下降,实验组则相对于对照组Bax的表达变化有所降低。说明肝硬化大鼠肝受损时,细胞内Bax由质向线粒体转移,而红花提取物则有效阻滞了Bax的转移。细胞色素C的表达则与Bax呈相反的趋势。(3)对照组肝细胞中Pro-caspase9和caspase3的表达明显高于空白组,而红花提取物处理后,肝细胞中Pro-caspase9和caspase3的表达较对照组明显下降。结论：本文运用DEN诱导大鼠肝硬化模型,并在模型中进行红花提取物处理,对大鼠肝组织损伤、炎性反应、氧化应激、线粒体功能、细胞凋亡等进行检测和分析,得到以下结论：1.红花提取物能明显减轻DEN诱导的大鼠肝硬化引起的肝组织损伤。2.红花提取物能有效抑制大鼠肝硬化引起的肝组织氧化应激和炎性反应。3.红花提取物能明显降低大鼠肝硬化诱导的肝细胞线粒体氧化应激。4.红花提取物能维持肝细胞线粒体ATP水平、呼吸控制率及磷氧比来保护线粒体的功能。5.红花提取物能抑制大鼠肝硬化引起的肝细胞凋亡。6.红花提取物影响肝细胞中细胞色素C和凋亡蛋白Bax、Pro-caspase9、caspase3的表达。综上所述,我们的研究显示红花提取物可以明显抑制大鼠肝硬化诱导的细胞线粒体呼吸功能受损,使得线粒体内的氧化还原反应正常进行,增强其抗氧化能力,起到减轻氧化应激的作用,进而减轻线粒体所受氧化损伤,另外,红花提取物能维持线粒体膜势能稳定并维持线粒体内渗透压在一个相对正常水平,抑制Bax由细胞质基质进入线粒体和细胞色素C进入细胞质基质,从而抑制凋亡因子Pro-caspase9、caspase3的表达,抑制细胞凋亡,以降低肝组织氧化应激,提高组织的抗氧化能力,并能通过抑制肝组织中的炎性细胞聚集及炎性因子释放,显著减轻组织的炎症程度,从而有效保护大鼠肝硬化引起的肝功能损伤。为红花提取物应用于辅助治疗大鼠肝硬化引起的损伤提供理论支持。
【图文】：
组织细胞形态出现异常；而经红花提取物处理的实验组，由肝硬化引逡逑起的上述组织损伤得到明显减轻，，可见纤维化及结节明显减少，炎性细胞浸润和逡逑组织细胞形态变化明显减弱（见图１）。逡逑W W灥逡逑图１；红花提取物对肝硬化大鼠肝组织形态结构有保护作用（Ｘ２００）。ａ．正常组（ＳＩ逡逑组）大鼠肝组织结构；ｂ．对照组（ＤＥＮ组）大鼠肝组织结构；Ｃ．实验组（ＤＥＮ＋ＣＴＬＥ逡逑组）大鼠肝组织结构。ＦＩ：纤维化逡逑３N２红花提取物能明显减轻大鼠肝硬化引起的ＡＬＴ和ＡＳＴ邋７］＜平上升逡逑当肝硬化大鼠的肝纽织出现纤维化时，血清中两氨酸转氨酶（ＡＬＴ）与天冬逡逑氨酸转氨酶（ＡＳＴ）的含量会X椄摺Ｎ颐羌觳饬耍茸榇笫蟪赡：螅爸堋ⅲ粗堋ⅲ钢苠义涎逯校粒蹋浴ⅲ粒樱缘暮俊７⑾稚硌嗡樯鲜隽较钪副暾Ｎ榷ǎ盏几斡不义希保板义
本文编号：2520576
【图文】：
组织细胞形态出现异常；而经红花提取物处理的实验组，由肝硬化引逡逑起的上述组织损伤得到明显减轻，，可见纤维化及结节明显减少，炎性细胞浸润和逡逑组织细胞形态变化明显减弱（见图１）。逡逑W W灥逡逑图１；红花提取物对肝硬化大鼠肝组织形态结构有保护作用（Ｘ２００）。ａ．正常组（ＳＩ逡逑组）大鼠肝组织结构；ｂ．对照组（ＤＥＮ组）大鼠肝组织结构；Ｃ．实验组（ＤＥＮ＋ＣＴＬＥ逡逑组）大鼠肝组织结构。ＦＩ：纤维化逡逑３N２红花提取物能明显减轻大鼠肝硬化引起的ＡＬＴ和ＡＳＴ邋７］＜平上升逡逑当肝硬化大鼠的肝纽织出现纤维化时，血清中两氨酸转氨酶（ＡＬＴ）与天冬逡逑氨酸转氨酶（ＡＳＴ）的含量会X椄摺Ｎ颐羌觳饬耍茸榇笫蟪赡：螅爸堋ⅲ粗堋ⅲ钢苠义涎逯校粒蹋浴ⅲ粒樱缘暮俊７⑾稚硌嗡樯鲜隽较钪副暾Ｎ榷ǎ盏几斡不义希保板义
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