推拿对脑瘫幼鼠海马炎症的拮抗作用与机制研究

发布时间：2019-08-27 08:21

【摘要】：目的 观察推拿对脑瘫(Cerebral palsy,CP)幼鼠海马炎症细胞因子TNF-α和IL-10蛋白表达的影响及其DNA甲基化水平,探索推拿对脑瘫幼鼠海马炎症的拮抗作用及机制。方法 从91只3日龄正常SD幼鼠中筛选符合研究标准的39只雄性幼鼠,随机分为3组:实验组(n=13)、模型对照组(n=13)和空白对照组(n=13),实验组和模型对照组采用左侧颈总动脉结扎联合缺氧3.5h的方法制备脑瘫模型,空白对照组不予处理。造模后第二天(即出生后第5天,Postnatal 5 days,P5),实验组开始进行推拿干预,1次/日,15 min/次,持续4周,空白对照组和模型对照组不予任何干预。三组相同的温度、湿度、生存环境及喂养方法。三组相同时间点进行动物行为学检测,即在P26天开始进行水迷宫实验(Morris Water Maze,MWM)和P31天进行跳台实验(Step-down Test,ST)以观察其学习记忆能力。P33天将全部实验幼鼠处死,取海马组织保存于-80℃环境备用。每组随机抽取7只用蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测TNF-α和IL-10的蛋白表达水平。将每组中剩余的6只随机分为两组,每组3只,分别采用Sequenom质谱检测法和焦磷酸测序法检测TNF-α和IL-10 DNA甲基化水平。结果1.水迷宫实验显示,与空白对照组相比,实验组潜伏期时间较长,两组差异有统计学意义(P0.05),与模型对照组相比,实验组潜伏期时间较短,但差异无统计学意义(P0.05)。与空白对照组相比,模型对照组大鼠找到平台的潜伏期明显较长,差异具有统计学意义(P0.05)。实验组穿越平台次数比模型对照组多,差异有统计学意义(P0.05),与空白对照组相比,两组间差异无统计学意义(P0.05)。与空白对照组相比,模型对照组穿越平台次数较少,差异有统计学意义(P0.05)。表明实验组Morris水迷宫成绩优于模型对照组,空白对照组优于实验组和模型对照组。2.跳台实验显示,实验组潜伏期时间长于模型对照组,短于空白对照组,差异无统计学意义(P0.05)。与空白对照组相比,模型对照组的潜伏期时间明显较短,差异具有统计学意义(P0.05)。三组跳下平台次数比较:空白对照组实验组模型对照组,实验组与模型对照组相比次数较少,差异有统计学意义(P0.05),实验组与空白对照组相比次数较多,差异有统计学意义(P0.05);模型对照组跳下平台次数多于空白对照组和实验组,差异有统计学意义(P0.05)。表明实验组跳台实验成绩优于模型对照组而差于空白对照组。3.western blot检测显示,实验组IL-10蛋白表达水平低于空白对照组,两组间差异无统计学意义(P0.05)。实验组和空白对照组IL-10蛋白表达水平高于模型对照组,差异有统计学意义(P0.05)。表明实验组IL-10蛋白表达水平高于模型对照组而低于空白对照组。实验组TNF-α蛋白表达水平高于空白对照组,差异无统计学意义(P0.05)。与模型对照组相比,实验组和空白对照组TNF-α蛋白表达水平较低,差异有统计学意义(P0.05)。表明实验组TNF-α蛋白表达水平低于模型对照组而高于空白对照组。4.Sequenom质谱检测结果:IL-10基因启动子区域,三组间4个Cp G位点相对甲基化率差异无统计学意义(P0.05)。模型对照组IL-10基因相对甲基化率略高于空白对照组和实验组,差异无统计学意义(P0.05)。表明三组间IL-10基因启动子区域甲基化水平差异不明显。TNF-α基因启动子区域中,实验组Cp G_8,9相对甲基化率高于模型对照组而低于空白对照组,三组间差异有统计学意义(P0.05);模型对照组Cp G_3、Cp G_8,9和Cp G_14相对甲基化率低于空白对照组,差异有统计学意义(P0.05)。表明三组间TNF-α基因启动子区域甲基化水平有差异。5.焦磷酸测序法检测结果:实验组、空白对照组和模型对照组在炎症因子IL-10的启动子区域的4个Cp G位点的DNA甲基化频率差异无统计学意义(P0.05)。表明三组间IL-10基因启动子区域甲基化水平差异不显著。实验组、空白对照组和模型对照组在炎症因子TNF-α的启动子区域的8个Cp G位点的DNA甲基化频率差异均有统计学意义(P0.05)。与空白对照组相比,实验组和模型对照组在位点Cp G_1、Cp G_2、Cp G_3、Cp G_4、Cp G_5、Cp G_6、Cp G_7的甲基化频率均显著降低,差异有统计学意义(P0.05)。与模型对照组相比,实验组在位点Cp G_1、Cp G_2、Cp G_4、Cp G_6、Cp G_7的甲基化频率明显升高,差异有统计学意义(P0.05)。而在Cp G_8,与空白对照组相比,实验组和模型对照组甲基化频率显著升高,差异有统计学意义(P0.05)。表明实验组TNF-α基因启动子区域甲基化水平高于模型对照组,而低于空白对照组。结论1.推拿可提高脑瘫幼鼠学习记忆能力。2.推拿可降低脑瘫幼鼠海马促炎细胞因子TNF-α蛋白表达水平,提高抗炎细胞因子IL-10的蛋白表达水平,重建脑瘫炎症的相对稳态。3.推拿对脑瘫幼鼠海马炎症细胞因子TNF-α和IL-10的蛋白表达的调节,其机制可能是推拿调控了炎症细胞因子TNF-α和IL-10的基因启动子区域甲基化水平,同时IL-10蛋白表达的改变可能也与其他因素的调节有关。
【学位授予单位】：云南中医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R244.1

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本文编号：2529642